Detta protokoll beskriver en metod för isolering av neutrofiler från helblod, buffy coats eller leukapheresis membran, uppnå god avkastning, hög renhet och minimal cellaktivering. Vi använder gradientrening, röda blodkroppar (RBC) sedimentering och RBC lys för att erhålla en högkvalitativ / renhet neutrophil beredning.
Neutrofiler (PMN) är de mest rikliga leukocyterna i mänsklig cirkulation, från 40 till 70% av de totala blodleukocyterna. De är de första cellerna som rekryteras på inflammationsplatsen via snabb extravasation genom kärl. Där utför neutrofiler en rad funktioner för att döda invaderande patogener och förmedla immunsignalering. Nyrenade neutrofiler från humant blod är den modell som valts för studier, eftersom ingen cellinje helt replikerar PMN-funktioner och biologi. Neutrofiler är dock kortlivade, terminalt differentierade celler och är mycket mottagliga för aktivering som svar på fysiska (temperatur, centrifugeringshastighet) och biologiska (endotoxin, kemo- och cytokiner) stimuli. Därför är det viktigt att följa en standardiserad, pålitlig och snabb metod för att få rena och icke-aktiverade celler. Detta protokoll presenterar ett uppdaterat protokoll som kombinerar densitet gradient centrifugering, röda blodkroppar (RBC) sedimentering och RBC lys för att erhålla hög PMN renhet och minimera cell aktivering. Dessutom diskuteras metoder för att bedöma neutrophil isolering kvalitet, livskraft och renhet också.
Det medfödda immunsystemet består av många celltyper som upprätthåller immunhomeostas och patogenfrigång tillsammans med många andra fysiologiska funktioner. Neutrofiler utgör den största poolen av vita blodkroppar i mänsklig cirkulation1. De flesta mogna neutrofiler lagras i benmärgen, som är platsen för generation för nya neutrofiler, även kallad granulopoiesis. I benmärgen lämnar granulocytprogenitorer cellcykeln och skiljer sig terminalt och förvärvar sina karakteristiska segmenterade kärnor och granulat2. Under inflammatoriska förhållanden, som svar på kemokiner, cytokiner och skadeassocierade och patogenassocierade molekylära mönster, mobiliseras neutrofiler från blodomloppet och ut ur benmärgen för att utföra ett brett spektrum av funktioner. Dessa inkluderar cytokinutsöndring, direkt fagocytos av patogenen, frisättning av reaktiva syrearter, avdämpning av antimikrobiella proteiner och bildandet av neutrophil extracellulära fällor.
De molekyler som används av neutrofiler för att bekämpa infektion är giftiga för mikroberna och värden. Således är livslängden och korrekt avlägsnande av åldrande / döende neutrofiler starkt reglerade, och de har en begränsad livslängd i omlopp (<48 h)3. På grund av denna korta överlevnad producerar människokroppen i genomsnitt 100 miljarder nya neutrofiler varje dag för att upprätthålla befolkningens homeostas4. Akut granulopoiesis kan ytterligare öka frisättningen av neutrofiler, både mogna och omogna, i blodet under inflammation och infektion5. Betydelsen av neutrofiler i det medfödda immunsvaret betonas av patienter med förvärvad eller medfödd neutropeni, som är mottagliga för bakterie- och svampinfektioner6.
Många utmaningar uppstår när man studerar neutrofilbiologi och deras roller i immunsvaret på grund av deras natur, inklusive deras korta överlevnad och cytotoxiska innehåll. Neutrofilliknande cellinjer har ofta differentierats från mänskliga promyelocytisk leukemi HL-60 celler och PLB-985 celler7,8. Även om de kan visa neutrofil-liknande morfologi och utföra chemotaxis, kan dessa cellinjer inte helt rekapitulera neutrofilers biologi. In vitro-analyser som använder dessa cellinjer kan inte heller rekapitulera in vivo-experiment. Dessutom måste differentieringen av dessa celler induceras och kan påverkas negativt av genmanipulation före differentiering.
Nyligen har metoder utvecklats för att kringgå dessa problem genom att använda inducible promotors för att modulera genuttryck post differentiering i HL-60 celler9. Även med sådana verktyg krävs primära mänskliga PN att validera mål med hjälp av farmakologiska metoder. Således är det absolut nödvändigt att erhålla rena och inaktiverade neutrofiler isolerade från blod för att validera resultaten av cellinje- och djurmodeller. Detta dokument presenterar ett reviderat PMN isoleringsprotokoll där för- och nackdelarna med nuvarande metoder utvärderades10. En kombination utformades bestående av gradient centrifugering för att separera PMNs från andra immunceller, kort dextran-baserade sedimentering för att ta bort huvuddelen av RBC lys via osmotic tryck och låg hastighet centrifugering för att ta bort trombocyt förorening.
På grund av den korta livslängden, terminal differentieringsstatus och lytiskt innehåll av neutrofiler har det alltid varit en utmaning att studera dessa celler. Förutom att använda musmodeller eller celler från patientkohorter är cellinjer användbara verktyg för att studera neutrofilbiologi16. Neutrofilliknande cellinjer kan dock inte helt upprepa alla aspekter av neutrofilbiologi, vilket lägger till ett extra lager av svårigheter att studera dessa celler. Den vanligaste in vitro-modellen är HL-60-cellinjen, som kan differentieras till neutrofilliknande celler genom behandling med dimetylsulfoxid eller retinsyra17,18. Även om dessa celler är användbara i studien av migration och andningssprängning, är de inte lämpliga för att studera neutrofilers mikrobiocida aktivitet. Andra cellinjer finns (PLB-98, NB4), och de är också associerade med deras uppsättning begränsningar19.
Det är avgörande att validera med primära mänskliga neutrophils observationer gjorda med mussjukdom modeller och cellinjer. Neutrofiler kan inte kryopreserveras effektivt och är därför ofta nyisolerade från helblod eller buffy coats som erhållits från givare och omedelbart bearbetas. När cellerna väl isolerats börjar de genomgå en komplex form av spontan död, reglerad av oxidation, cytoplasmiska caspaser och proteaser som finns i neutrofilgranulat20,21. Felaktiga isoleringsmetoder eller tekniker kan leda till aktivering av neutrofiler, vilket bara påskyndar celldöden. Det är absolut nödvändigt att ha en tillförlitlig och konsekvent metod för att få rena och högkvalitativa neutrofiler från givare.
Det har publicerats många metoder på mänsklig neutrofilisolering10,22. De delas huvudsakligen in i två kategorier, med vissa gemensamma strategier. Den första kategorin är antikroppsbaserad, antingen genom positivt eller negativt urval. Positivt urval skulle märka neutrofiler direkt, vilket ger en mycket ren cellpopulation, även om det också leder till snabb cellaktivering, celldöd samt oönskad taggning av neutrofiler23. Negativt urval, även om cellerna lämnas omärkta och ger en mycket ren population, accelererad neutrofil död, även om den exakta mekanismen är okänd (figur 5). Huruvida gen- eller proteinuttryck också ändras efter positivt eller negativt urval behöver undersökas ytterligare. På grund av den mängd antikroppar som behövs för att tömma de andra typerna av celler kan dessa metoder inte heller producera stora mängder neutrofiler. Antikroppsbaserade analyser kan dock fortfarande användas för korttidskultur och experiment i mindre skala och är metoder för experiment som kräver mycket hög cellrenhet, såsom gen- och proteinuttrycksstudier.
Den andra typen av isoleringsmetod är gradient- och densitetsbaserad. Det involverar vanligtvis Percoll, Ficoll-Paque eller andra polysackarrid/polyvinylpyrrolidonkomponenter och använder centrifugeringskraft för att separera olika typer av blodkroppar baserat på celltäthet. Dessa metoder kompletteras ofta med sedimentering av röda blodkroppar genom dextran. Dessa metoder kan hantera större skalor av utgångsmaterial och kan också uppnå hög renhet. En varning för densitetsbaserad isolering är den ineffektiva separationen av andra mycket mindre rikliga granulocyter (mestadels eosinofiler) från neutrofiler, och det är därför den största begränsningen av protokollet som presenteras, eftersom även närvaron av små cellföroreningar kan påverka neutrofilsvar24.
Presenteras här är en sammanfattad metod baserad på gradientisolering, raffinering av tidigare metoder10,22. Vi använder den nuvarande underutstaten av neutrofil specificiteter för att tillförlitligt isolera rena mänskliga neutrofiler med begränsad kvarvarande trombocyt och RBC, förhindra neutrophil aktivering och accelererad död. Det viktigaste steget är skiktningen av gradienten, som erhålls mycket mer effektivt genom att lägga till densitetsgradientmediet under blodet för att få ett skarpt gränssnitt. En snabb undersökning av PBMC-ringen och gradienten efter centrifugering kan avslöja eventuell förorening, aktivering och låga utbyten. Vid arbete med ett leukaferesmembran eller buffy coat är utspädning av blodet viktigt eftersom överdriven celltäthet skulle leda till cellaggregering, vilket leder till föroreningar och cellaktivering.
Detta protokoll bör slutföras inom 2 timmar för att säkerställa cellens färskhet, och steg som involverar densitet gradient medium, dextran och lys görs omedelbart, eftersom exponering för dessa lösningar kan förändra neutrofiler. Med detta protokoll är den förväntade avkastningen av neutrofiler minst ~ 10 miljoner / 10 ml helblod och minst ~ 60 miljoner / 10 ml buffy coat. Utvärdering av isoleringskvaliteten bör göras på följande sätt: aktiverade neutrofiler bör vara mindre än 10%, lymfocytförorening lägre än 5%, minimal eosinofil (samma sida spridning men lägre framåt spridning population) och cell livskraft bör vara över 90%. Lägre renhet kan bero på felaktig skiktning eller lagring av densitetsgradientmediet eller på grund av kvaliteten och färskheten hos startblodprodukten.
The authors have nothing to disclose.
Detta projekt stöddes av P01HL095489. A.Y.H stöddes av T32HL066987.
3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell technologies | #07060 | |
Attune NxT | invitrogen | A24858 | FACS analyzer |
Cd11b-PE | biolegend | 301305 | |
CD14-BV421 | biolegend | 367144 | |
CD193-BV605 | biolegend | 310716 | |
CD19-PerCP | biolegend | 302228 | |
CD3-PerCP | biolegend | 300326 | |
CD41-APC | biolegend | 303710 | |
Cd45-APC | biolegend | 103111 | |
CD62L-PE | biolegend | 304802 | |
CD66b-FITC | biolegend | 305103 | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | Centrifuge |
Dextran | Fisher | BP1580 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D systems | S11150H | complement inactivation of FBS is recommended |
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD | 556547 | |
Hanks balanced salt solution (-CaCl2), (-MgCl2) (-MgSO4) | Gibco | 14175-095 | HBSS without Ca2+/Mg2+ is advised as they have been shown to lead to neutrohpil activation |
Lymphoprep | Stemcell technologies | #07801 | density gradient medium |
MACSxpress Whole Blood Neutrophil Isolation Kit, human | Miltenyi | 130-104-434 | |
RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | |
Sodium chloride | sigma | 71376 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
ultrapure water | KD medical | RGF-3410 |