यह प्रोटोकॉल पूरे रक्त, बफी कोट, या ल्यूकाफेरिस झिल्ली से न्यूट्रोफिल के अलगाव के लिए एक विधि का विवरण देता है, जो अच्छी उपज, उच्च शुद्धता और न्यूनतम कोशिका सक्रियण को प्राप्त करता है। हम उच्च गुणवत्ता/शुद्धता न्यूट्रोफिल तैयारी प्राप्त करने के लिए ढाल शुद्धिकरण, लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) तलछट, और आरबीसी लाइसिस का उपयोग करते हैं ।
न्यूट्रोफिल (पीएमएन) मानव परिसंचरण में सबसे प्रचुर मात्रा में ल्यूकोसाइट्स हैं, जो कुल रक्त ल्यूकोसाइट्स के 40 से 70% तक हैं। वे जहाजों के माध्यम से तेजी से अतिव्यवसंकरण के माध्यम से सूजन की साइट पर भर्ती पहली कोशिकाएं हैं । वहां, न्यूट्रोफिल रोगजनकों पर हमला करने और प्रतिरक्षा संकेत मध्यस्थता करने के लिए कार्यों की एक सरणी करते हैं। मानव रक्त से हौसले से शुद्ध न्यूट्रोफिल अध्ययन के लिए पसंद के मॉडल हैं, क्योंकि कोई सेल लाइन पूरी तरह से पीएमएन कार्यों और जीव विज्ञान की प्रतिकृति नहीं है। हालांकि, न्यूट्रोफिल अल्पकालिक, मरणासन्न विभेदित कोशिकाएं हैं और भौतिक (तापमान, अपकेंद्रित्र गति) और जैविक (एंडोटॉक्सिन, कीमो-और साइटोकिन्स) उत्तेजनाओं के जवाब में सक्रियण के लिए अतिसंवेदनशील होती हैं। इसलिए, शुद्ध और गैर-सक्रिय कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक मानकीकृत, विश्वसनीय और तेज विधि का पालन करना महत्वपूर्ण है। यह प्रोटोकॉल उच्च पीएमएन शुद्धता प्राप्त करने और सेल सक्रियण को कम करने के लिए घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र, लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) तलछट, और आरबीसी लाइसिस के संयोजन के लिए एक अद्यतन प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। इसके अलावा, न्यूट्रोफिल अलगाव की गुणवत्ता, व्यवहार्यता और शुद्धता का आकलन करने के तरीकों पर भी चर्चा की जाती है।
जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली में कई सेल प्रकार शामिल हैं जो कई अन्य शारीरिक कार्यों के साथ प्रतिरक्षा होमोस्टेसिस और रोगजनक निकासी को बनाए रखते हैं। न्यूट्रोफिल में मानव परिसंचरण में सफेद रक्त कोशिकाओं का सबसे बड़ा पूल शामिल है1. अधिकांश परिपक्व न्यूट्रोफिल बोन मैरो में संग्रहीत होते हैं, जो नए न्यूट्रोफिल के लिए पीढ़ी की साइट है, जिसे ग्रैनुलोपोइस भी कहा जाता है। बोन मैरो में, ग्रेनुलोसाइट जनक कोशिका चक्र से बाहर निकलते हैं और मरणासन्न अंतर करते हैं, उनकी विशिष्ट खंडित नाभिक और कणिकाएं2प्राप्त करते हैं। भड़काऊ परिस्थितियों में, केमोकिन, साइटोकिन्स, और क्षति से जुड़े और रोगजनक से जुड़े आणविक पैटर्न के जवाब में, न्यूट्रोफिल रक्त के बहाव से और अस्थि मज्जा से बाहर हुए कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला करने के लिए जुटाए जाते हैं। इनमें साइटोकिन स्राव, रोगजनक का प्रत्यक्ष फागोसिटोसिस, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की रिहाई, एंटीमाइक्रोबियल प्रोटीन का डीग्रेंशन, और न्यूट्रोफिल एक्सपेरिमेंटल ट्रैप का निर्माण शामिल है।
संक्रमण से लड़ने के लिए न्यूट्रोफिल द्वारा उपयोग किए जाने वाले अणु रोगाणुओं और मेजबान के लिए जहरीले होते हैं। इस प्रकार, जीवन काल और उम्र बढ़ने/मरने वाले न्यूट्रोफिल को उचित रूप से हटाना अत्यधिक विनियमित होता है, और उनका जीवन काल प्रचलन में सीमित होता है (<48 एच)3। इस छोटे से अस्तित्व के कारण, मानव शरीर जनसंख्या होरोस्टेसिस4को बनाए रखने के लिए हर दिन औसतन 100 बिलियन नए न्यूट्रोफिल का उत्पादन करता है। आपातकालीन ग्रैनुलोपोइस सूजन और संक्रमण 5 केदौरानरक्त में परिपक्व और अपरिपक्व दोनों न्यूट्रोफिल की रिहाई को और बढ़ा सकता है। जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में न्यूट्रोफिल के महत्व को अधिग्रहीत या जन्मजात न्यूट्रोपेनिया वाले रोगियों द्वारा हाइलाइट किया जाता है, जो बैक्टीरियल और फंगल संक्रमण6के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं।
न्यूट्रोफिल जीव विज्ञान का अध्ययन करते समय कई चुनौतियां उत्पन्न होती हैं और उनकी प्रकृति के कारण प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में उनकी भूमिकाएं, जिनमें उनकी छोटी जीवित रहने और साइटोटॉक्सिक सामग्री शामिल है। न्यूट्रोफिल जैसी कोशिका रेखाओं को आमतौर पर मानव प्रोमाइलोसिटिक ल्यूकेमिया एचएल-60 कोशिकाओं और पीएलबी-985 कोशिकाओं7,8से अलग किया गया है। हालांकि वे न्यूट्रोफिल की तरह आकृति विज्ञान प्रदर्शित कर सकते हैं और केमोटैक्सिस प्रदर्शन कर सकते हैं, इन सेल लाइनों को पूरी तरह से न्यूट्रोफिल के जीव विज्ञान का पुनर्मूल्यांकन नहीं कर सकते । इन सेल लाइनों का उपयोग कर इन विट्रो परख भी वीवो प्रयोगों में पुनः आत्मसमर्पण करने में असमर्थ हैं। इसके अलावा, इन कोशिकाओं के भेदभाव को प्रेरित करने की जरूरत है और भेदभाव से पहले जीन हेरफेर से प्रतिकूल रूप से प्रभावित हो सकता है ।
हाल ही में, एचएल-60 कोशिकाओं में भेदभाव के बाद जीन अभिव्यक्ति को मिलाना करने के लिए अकक्षीय प्रमोटरों का उपयोग करके इनमुद्दोंको दरकिनार करने के तरीके विकसित किए गए हैं। यहां तक कि ऐसे उपकरणों के साथ, प्राथमिक मानव पीएमएन को औषधीय दृष्टिकोणों का उपयोग करके लक्ष्यों को मान्य करने की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, सेल लाइन और पशु मॉडल के निष्कर्षों को मान्य करने के लिए रक्त से अलग शुद्ध और निष्क्रिय न्यूट्रोफिल प्राप्त करना अनिवार्य है। यह पत्र एक संशोधित पीएमएन आइसोलेशन प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जिसमें वर्तमान तरीकों के पेशेवरों और विपक्षों का मूल्यांकन10किया गया था। एक संयोजन ढाल अपकेंद्रित्र से अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं से पीएमएन अलग करने के लिए तैयार किया गया था, लघु डेक्सट्रन आधारित तलछट आरबीसी के थोक को दूर करने के लिए, तेजी से अवशिष्ट आरबीसी लाइसिस के माध्यम से osmotic दबाव, और प्लेटलेट संदूषण को दूर करने के लिए कम गति अपकेंद्रित्र ।
छोटे जीवन काल, टर्मिनल भेदभाव की स्थिति, और न्यूट्रोफिल की lytic सामग्री के कारण, इन कोशिकाओं का अध्ययन हमेशा एक चुनौती रही है। रोगी साथियों से माउस मॉडल या कोशिकाओं का उपयोग करने के अलावा, सेल लाइनें न्यूट्रोफिल जीव विज्ञान16का अध्ययन करने में मदद करने के लिए उपयोगी उपकरण हैं। हालांकि, न्यूट्रोफिल जैसी सेल लाइनें न्यूट्रोफिल जीव विज्ञान के सभी पहलुओं को पूरी तरह से दोहरा नहीं सकती हैं, जिससे इन कोशिकाओं का अध्ययन करने में कठिनाई की एक अतिरिक्त परत जोड़ दी जाती है । सबसे अधिक इन विट्रो मॉडल एचएल-60 सेल लाइन है, जिसे डाइमिथाइल्सुल्फोक्साइड या रेटिनोइक एसिड17, 18के साथ उपचार द्वारा न्यूट्रोफिल जैसी कोशिकाओं में विभेदित किया जा सकता है। हालांकि ये कोशिकाएं माइग्रेशन और श्वसन फटने के अध्ययन में उपयोगी होती हैं, लेकिन वे न्यूट्रोफिल की माइक्रोबायोसाइड गतिविधि का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त नहीं हैं। अन्य सेल लाइनें मौजूद हैं (पीएलबी-98, एनबी 4), और वे19सीमाओं के अपने सेट के साथ भी जुड़े हुए हैं।
माउस रोग मॉडल और सेल लाइनों के साथ किए गए प्राथमिक मानव न्यूट्रोफिल टिप्पणियों के साथ मान्य करना निर्णायक है। न्यूट्रोफिल को कुशलतापूर्वक क्रायोप्रेवित नहीं किया जा सकता है और इस प्रकार अक्सर रक्तदाताओं से प्राप्त पूरे रक्त या बफी कोट से ताजा अलग किया जाता है और तुरंत संसाधित किया जाता है। एक बार अलग होने के बाद, कोशिकाएं सहज मृत्यु के जटिल रूप से गुजरना शुरू कर देती हैं, जो ऑक्सीकरण, साइटोप्लाज्मिक कैपेस और न्यूट्रोफिल कणिकाओं20, 21में पाए जाने वाले प्रोटीज द्वारा विनियमित होती हैं। अनुचित अलगाव विधियों या तकनीकों से न्यूट्रोफिल की सक्रियता हो सकती है, केवल सेल निधन में तेजी आ सकती है। दानदाताओं से शुद्ध और उच्च गुणवत्ता वाले न्यूट्रोफिल प्राप्त करने के लिए एक विश्वसनीय और सुसंगत विधि होना अनिवार्य है।
मानव न्यूट्रोफिल आइसोलेशन10,22पर कई तरीके प्रकाशितहुएहैं . वे मुख्य रूप से दो श्रेणियों में आते हैं, कुछ साझा रणनीतियों के साथ । पहली श्रेणी एंटीबॉडी आधारित है, या तो सकारात्मक या नकारात्मक चयन के माध्यम से किया जा रहा है । सकारात्मक चयन सीधे न्यूट्रोफिल लेबल करेगा, इसलिए एक अत्यधिक शुद्ध सेल आबादी प्रदान करता है, हालांकि यह तेजी से सेल सक्रियण, सेल मृत्यु, साथ ही न्यूट्रोफिल23की अवांछित टैगिंग की ओर भी जाता है। नकारात्मक चयन, हालांकि कोशिकाओं को अवेलेबल छोड़कर और एक बहुत ही शुद्ध आबादी दे रहा है, त्वरित न्यूट्रोफिल मौत, हालांकि सटीक तंत्र अज्ञात है(चित्रा 5)। क्या सकारात्मक या नकारात्मक चयन के बाद जीन या प्रोटीन अभिव्यक्ति को भी बदल दिया जाता है, इसकी आगे जांच की जरूरत है । इसके अलावा, अन्य प्रकार की कोशिकाओं को कम करने के लिए आवश्यक एंटीबॉडी की मात्रा के कारण, ये विधियां बड़ी मात्रा में न्यूट्रोफिल का उत्पादन नहीं कर सकतीं। हालांकि, एंटीबॉडी आधारित परख अभी भी एक छोटे पैमाने पर अल्पकालिक संस्कृति और प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और इस तरह के जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति अध्ययन के रूप में बहुत उच्च सेल शुद्धता की आवश्यकता प्रयोगों के लिए पसंद के तरीके हैं ।
दूसरे प्रकार की अलगाव विधि ढाल और घनत्व आधारित है। इसमें आमतौर पर परकोल, फिकोल-पैक, या अन्य पॉलीसैकराइड/पॉलीविनाइलपाइरोलिज्ड घटक शामिल होते हैं और कोशिका घनत्व के आधार पर विभिन्न प्रकार की रक्त कोशिकाओं को अलग करने के लिए अपकेंद्रित्र बल का उपयोग करते हैं। इन तरीकों को अक्सर डेक्सट्रान द्वारा लाल रक्त कोशिकाओं के तलछट के साथ पूरित किया जाता है। ये विधियां शुरू करने की सामग्री के बड़े पैमाने को संभाल सकती हैं और उच्च शुद्धता भी प्राप्त कर सकती हैं। घनत्व-आधारित अलगाव की एक चेतावनी न्यूट्रोफिल से अन्य कम प्रचुर मात्रा में ग्रैनुलोसाइट्स (ज्यादातर इओसिनोफिल) का अक्षम पृथक्करण है, और इसलिए, यह प्रस्तुत प्रोटोकॉल की प्रमुख सीमा है, क्योंकि छोटे सेल संदूषण की उपस्थिति भी न्यूट्रोफिल प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकती है24।
यहां प्रस्तुत एक सारांशित विधि है जो ढाल अलगाव पर आधारित है, पिछले तरीकों को परिष्कृत करतेहैं 10,22। हम न्यूट्रोफिल सक्रियण और त्वरित मृत्यु को रोकने, सीमित अवशिष्ट प्लेटलेट और आरबीसी के साथ शुद्ध मानव न्यूट्रोफिल को मज़बूती से अलग करने के लिए न्यूट्रोफिल विशिष्टताओं के वर्तमान अंडरकभाषी का उपयोग करते हैं। सबसे महत्वपूर्ण कदम ढाल की परत है, जो एक तेज इंटरफ़ेस प्राप्त करने के लिए रक्त के नीचे घनत्व ढाल माध्यम जोड़कर अधिक प्रभावी ढंग से प्राप्त किया जाता है। पीबीएमसी रिंग की त्वरित जांच और अपकेंद्रित्र के बाद ढाल संभावित संदूषण, सक्रियण और कम पैदावार का पता लगा सकता है। ल्यूकाफेरिस झिल्ली या बफी कोट के साथ काम करते समय, रक्त को पतला करना महत्वपूर्ण है क्योंकि अत्यधिक सेल घनत्व सेल एकत्रीकरण का कारण बनेगा, जिससे अशुद्धियों और सेल सक्रियण होगा।
इस प्रोटोकॉल को सेल ताजगी सुनिश्चित करने के लिए 2 घंटे के भीतर पूरा किया जाना चाहिए, और घनत्व ढाल माध्यम, डेक्सट्रान और लाइसिस से जुड़े कदम तुरंत किए जाने चाहिए, क्योंकि इन समाधानों के संपर्क में न्यूट्रोफिल को बदल सकते हैं। इस प्रोटोकॉल के साथ, न्यूट्रोफिल की अपेक्षित उपज कम से कम ~ 10 मिलियन/10 एमएल पूरे रक्त और कम से कम ~ 60 मिलियन/10 एमएल बफी कोट है। अलगाव की गुणवत्ता का मूल्यांकन इस प्रकार किया जाना चाहिए: सक्रिय न्यूट्रोफिल 10% से कम होना चाहिए, लिम्फोसाइट संदूषण 5% से कम, न्यूनतम इओसिनोफिल (एक ही तरफ तितर-बितर लेकिन कम आगे स्कैटर आबादी), और सेल व्यवहार्यता 90% से अधिक होनी चाहिए। कम शुद्धता घनत्व ढाल माध्यम के अनुचित परत या भंडारण या शुरुआती रक्त उत्पाद की गुणवत्ता और ताजगी के कारण हो सकती है।
The authors have nothing to disclose.
इस परियोजना को P01HL095489 द्वारा समर्थित किया गया था। A.Y.H T32HL066987 द्वारा समर्थित था ।
3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell technologies | #07060 | |
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Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D systems | S11150H | complement inactivation of FBS is recommended |
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD | 556547 | |
Hanks balanced salt solution (-CaCl2), (-MgCl2) (-MgSO4) | Gibco | 14175-095 | HBSS without Ca2+/Mg2+ is advised as they have been shown to lead to neutrohpil activation |
Lymphoprep | Stemcell technologies | #07801 | density gradient medium |
MACSxpress Whole Blood Neutrophil Isolation Kit, human | Miltenyi | 130-104-434 | |
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Sodium chloride | sigma | 71376 | |
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ultrapure water | KD medical | RGF-3410 |