قياس تكوين CD95 الموت المسببة للإشارات المعقدة ومعالجة Procaspase-8 في هذا المجمع
Summary
هنا، يتم تقديم سير عمل تجريبي يمكن من الكشف عن معالجة caspase-8 مباشرة في مجمع الإشارات المسببة للوفاة (DISC) ويحدد تكوين هذا المجمع. هذه المنهجية لها تطبيقات واسعة النطاق، من كشف الآليات الجزيئية لمسارات موت الخلايا إلى النمذجة الديناميكية لشبكات موت الخلايا المبرمج.
Abstract
يتم التوسط في موت الخلايا المبرمج ال extrinsic عن طريق تنشيط مستقبلات الموت (DRs) مثل CD95/Fas/APO-1 أو الليغاند المسبب لداء موت الخلايا المبرمج المرتبط بعامل الورم (TRAIL) – مستقبلات 1/مستقبلات 2 (TRAIL-R1/R2). تحفيز هذه المستقبلات مع ليغاندس cognate يؤدي إلى تجميع مجمع الإشارات المسببة للموت (DISC). القرص يتكون DR، البروتين المحول Fas المرتبطة مع مجال الموت (FADD)، procaspases-8/-10، والخلوية مثل FADD interleukin (IL) -1β تحويل البروتينات المثبطة للإنزيم (c-FLIPs). القرص بمثابة منصة لمعالجة procaspase -8 والتنشيط. يحدث هذا الأخير عن طريق التعتيم / oligomerization في مجال تأثير الموت (DED) خيوط تجميعها في القرص.
ويتبع تنشيط procaspase-8 معالجتها، والذي يحدث في عدة خطوات. في هذا العمل ، يتم وصف سير عمل تجريبي ثابت يسمح بقياس تكوين DISC ومعالجة procaspase-8 في هذا المجمع. ويستند سير العمل على تقنيات التكفير المناعي المدعومة بتحليل البقع الغربية. هذا سير العمل يسمح رصد دقيق لخطوات مختلفة من procaspase-8 التوظيف إلى القرص ومعالجتها، وهي ذات صلة عالية للتحقيق في الآليات الجزيئية للخلايا المبرمج extrinsic.
Introduction
واحدة من مستقبلات الموت الأكثر دراسة (DRs) هو CD95 (Fas, APO-1). يبدأ المسار الأبوبتوتيكي extrinsic مع تفاعل DR مع ليغند cognate لها، أي CD95L يتفاعل مع CD95 أو تريل يربط تريل-Rs. وهذا يؤدي إلى تشكيل القرص في القرص DR. المقابلة يتكون من CD95، FADD، procaspase-8/-10، وC-FLIP البروتينات1،2. وعلاوة على ذلك، يتم تجميع القرص عن طريق التفاعلات بين مجال الموت (DD) التي تحتوي على البروتينات، مثل CD95 و FADD، والبروتينات المحتوية على DED مثل FADD، procaspase-8/-10، وc-FLIP (الشكل 1). Procaspase-8 يخضع لoligomerization عن طريق جمعية من DEDs لها، مما أدى إلى تشكيل خيوط DED، تليها تنشيط procaspase-8 وتجهيزها. وهذا يؤدي إلى سلسلة كاسباس، مما يؤدي إلى موت الخلية (الشكل 1)3،4. وهكذا، procaspase-8 هو caspase البادئ المركزي للمسار الخلايا المبرمج extrinsic بوساطة CD95 أو تريل-Rs، تفعيلها في منصة الجزيئية الكلية المقابلة، القرص.
اثنين من isoforms من procaspase -8 ، وهي procaspase – 8a (p55) و -8b (p53) ، ومن المعروف أن يتم تجنيدهم في القرص5. كلا isoforms تتألف من اثنين من DEDs. يقع DED1 و DED2 في الجزء N-terminal من procaspase-8a/b متبوعا بنطاقي p18 و p10 الحفازين. كشف التحليل التفصيلي المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) ل procaspase-8 DEDs عن تجميع بروتينات procaspase-8 في هياكل خيوط تسمى خيوط DED4،6. ومن اللافت للنظر أن سلاسل procaspase-8 الخطية اقترحت في البداية للمشاركة في التعتيم يليه تنشيط procaspase-8 في DISC. الآن، ومن المعروف أن تلك السلاسل ليست سوى بنية فرعية من خيوط بروكاسباس-8 DED، وهذا الأخير يتألف من ثلاث سلاسل تجميعها في الحلزون الثلاثي3،4،6،7.
عند التعتيم في خيوط DED ، تؤدي التغييرات التشكيلية في procaspase-8a /b إلى تشكيل المركز النشط للبروكاسباس -8 وتفعيله3،8. ويتبع ذلك معالجة procaspase-8 ، والتي يتم التوسط فيها عبر مسارين: الأول يمر عبر توليد منتج شق p43/p41 والثاني عبر الجيل الأولي من منتج الانقسام p30. يبدأ مسار p43/p41 من خلال انشقاق procaspase-8a/b في Asp374 ، مما أدى إلى منتجات الانقسام p43/p41 و p12 (الشكل 2). وعلاوة على ذلك، يتم قطع هذه الشظايا تلقائيا بشكل تحفيزي في Asp384 و Asp210/216، مما أدى إلى تشكيل التروتروترمر caspase-8 النشط، p102/p1829،10،11. وبالإضافة إلى ذلك، تبين أنه بالتوازي مع مسار p43/p41 للمعالجة، procaspase-8a/b هو أيضا مشقوق في Asp216، مما يؤدي إلى تشكيل المنتج C-محطة الانقسام p30، تليها بروتيوليسيس إلى p10 و P1810 (الشكل 2).
Procaspase-8a/b التنشيط في خيوط DED ينظم بدقة من قبل البروتينات المسماة c-FLIPs12. تحدث بروتينات c-FLIP في ثلاثة أشكال متساوية: c-FLIPLong (c-FLIPL)،c-FLIPShort (c-FLIPS)،وc-FLIPRaji (c-FLIPR). تحتوي جميع الأشكال الثلاثة على اثنين من DEDs في منطقة N-terminal الخاصة بهم. ج-فليبL أيضا C-محطة نشطة بشكل حفاز caspase مثل المجال12,13. كل isoforms قصيرة من C-FLIP-C-FLIPS و C-FLIPR-العملبطريقة مضادة للapoptotic عن طريق تعطيل تشكيل خيوط DED في القرص6,14,15. وبالإضافة إلى ذلك، C-FLIPL يمكن تنظيم caspase-8 التنشيط بطريقة تعتمد على التركيز. وهذا يمكن أن يؤدي إلى كل من الموالية ومكافحة apoptotic آثار16,17,18. من خلال تشكيل procaspase-8/c-FLIPL heterodimer النشطة تحفيزيا، c-FLIPL يؤدي إلى استقرار المركز النشط من procaspase-8 وتفعيله. تعتمد الدالة المؤيدة أو المضادة للأبوبتوتيك ل c-FLIPL بشكل مباشر على مقدارها في خيوط DED والمبلغ اللاحق من procaspase-8/c-FLIPL heterodimers19. تركيزات منخفضة أو متوسطة من C-FLIPL في DISC يؤدي إلى كميات كافية من التروديمرات procaspase-8/c-FLIPL في خيوط DED، والتي تدعم تنشيط caspase-8. في المقابل، زيادة كميات C-FLIPL يؤدي مباشرة إلى آثارها المضادة لل أبوتوبوتيك في القرص20.
معا، وتنشيط وتجهيز procaspase-8a/b في القرص هو عملية منظمة للغاية تنطوي على عدة خطوات. تناقش هذه الورقة قياس معالجة procaspase-8 مباشرة في DISC بالإضافة إلى تحليل تكوين هذا المجمع. وسيتم تقديم هذا باستخدام CD95 DISC كمجمع DR المثالي.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد وصف هذا النهج في البداية كيشكل وآخرون27 وقد طورته بنجاح منذ ذلك الحين عدة مجموعات. ويتعين النظر في عدة مسائل هامة من أجل كفاءة معالجة الكاسباس -8 في هذا المجمع.
أولا، من الضروري اتباع جميع خطوات الغسيل أثناء التكفير المناعي. أهمية خاصة هي الخطوات النهائية لغس?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نعترف بمؤسسة فيلهلم ساندر (2017.008.02)، ومركز الأنظمة الديناميكية (CDS)، الممول من قبل صندوق التنمية الإقليمية الأوروبي (صندوق التنمية الإقليمية الأوروبي) وبرنامج DFG (LA 2386) لدعم عملنا. نشكر كارينا غوتيك لدعمها تجاربنا. نحن نعترف البروفيسور ديرك راينهولد (OvGU، ماغديبورغ) لتوفير لنا الخلايا التائية الأولية.
Materials
| 12.5% SDS gel | self made | for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED |
|
| 14.5 cm cell dishes | Greiner | 639160 | |
| acrylamide | Carl Roth | A124.1 | |
| anti-actin Ab | Sigma Aldrich | A2103 | dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-APO-1 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo | ALX-805-038-C100 | used only for immunoprecipitation |
| anti-caspase-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-3 Ab | cell signaling | 9662 S | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-8 Ab C15 | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-242-C100 | dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-c-FLIP NF6 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-961-0100 | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-FADD 1C4 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ADI-AAM-212-E | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-PARP Ab | cell signaling | 9542 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| APS | Carl Roth | 9592.3 | |
| β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.2 | |
| Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml |
Bio Rad | 500-0006 | used according to manufacturer's instructions |
| CD95L | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-522-020-C005 | |
| chemoluminescence detector Chem Doc XRS+ |
Bio Rad | ||
| cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | prepared according to manufacturer's instructions |
| DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge |
| eletrophoresis buffer | self made | 10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage |
|
| glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Mouse IgG2b | SouthernBiotech | 1090-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Interleukin-2 Human(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | for activation of T cells |
| KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
| loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL |
Bio Rad | 161-0747 | prepared according to manufacturer's instructions |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUFO500 | |
| lysis buffer | self made | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O |
|
| medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium |
| medium for primary T cells | gibco by Life Technologie | 21875034 | adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium |
| milk powder | Carl Roth | T145.4 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| PBST | self made | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage |
|
| PBST + 5% milk | self made | 50 g milk powder + 1 L PBST | |
| PHA | Thermo Fisher Scientific | R30852801 | for actavation of T ells |
| Power Pac HC | Bio Rad | ||
| Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | use between 3-5 µL |
| Protein A Sepharose CL-4B beads | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions |
| scraper | VWR | 734-2602 | |
| SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
| shaker | Heidolph | ||
| sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer | Bio Rad | 10026938 | prepared according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
| Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |
References
- Lavrik, I. N., Krammer, P. H. Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC. Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).
- Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. Life and death in peripheral T cells. Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).
- Dickens, L. S., et al. A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death. Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).
- Fu, T. -. M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
- Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).
- Fox, J. L., et al. Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
- Schleich, K., et al. Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model. Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).
- Hughes, M. A., et al. Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival. Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).
- Lavrik, I., et al. The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2]. Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).
- Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation. Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).
- Golks, A., et al. The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation. Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).
- Oztürk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions. Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).
- Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).
- Hughes, M. A., et al. Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate. Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).
- Hillert, L. K., et al. Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly. Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).
- Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).
- Micheau, O., et al. The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).
- Chang, D. W., et al. C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis. EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).
- Hillert, L. K., et al. Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer. Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).
- Fricker, N., et al. Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL. Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).
- Arndt, B., et al. Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation. Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).
- Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network. Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).
- Schleich, K., et al. Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain. Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).
- Lavrik, I. N., et al. Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling. Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).
- Sprick, M. R., et al. Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8. EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).
- Neumann, L., et al. Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells. Molecular Systems Biology. 6 (1), 352 (2010).
- Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).
- Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways. Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).
- Kallenberger, S. M., et al. Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis. Science Signaling. 7 (316), 23 (2014).
