Het meten van de samenstelling van cd95-doodsopwekkend signaleringscomplex en verwerking van procaspase-8 in dit complex
Summary
Hier wordt een experimentele workflow gepresenteerd die de detectie van caspase-8-verwerking direct bij het death-inducerende signaleringscomplex (DISC) mogelijk maakt en de samenstelling van dit complex bepaalt. Deze methodologie heeft brede toepassingen, van het ontrafelen van de moleculaire mechanismen van celdoodroutes tot de dynamische modellering van apoptosenetwerken.
Abstract
Extrinsieke apoptose wordt gemedieerd door de activering van doodsreceptoren (DRs) zoals CD95 / Fas / APO-1 of tumornecrosefactor-gerelateerde apoptose-inducerende ligand (TRAIL) – receptor 1 / receptor 2 (TRAIL-R1 / R2). Stimulatie van deze receptoren met hun verwante liganden leidt tot de assemblage van het dood-inducerende signaleringscomplex (DISC). DISC bestaat uit DR, het adaptoreiwit Fas-geassocieerd eiwit met death domain (FADD), procaspases-8/-10 en cellulaire FADD-achtige interleukine (IL)-1β-converterende enzym-remmende eiwitten (c-FLIPs). De DISC dient als platform voor procaspase-8 verwerking en activering. Dit laatste gebeurt via zijn dimerisatie/oligomerisatie in de death effector domain (DED) filamenten geassembleerd op de DISC.
Activering van procaspase-8 wordt gevolgd door de verwerking ervan, die in verschillende stappen plaatsvindt. In dit werk wordt een gevestigde experimentele workflow beschreven die de meting van DISC-vorming en de verwerking van procaspase-8 in dit complex mogelijk maakt. De workflow is gebaseerd op immunoprecipitatietechnieken die worden ondersteund door western blot-analyse. Deze workflow maakt zorgvuldige monitoring van verschillende stappen van procaspase-8-rekrutering voor de DISC en de verwerking ervan mogelijk en is zeer relevant voor het onderzoeken van moleculaire mechanismen van extrinsieke apoptose.
Introduction
Een van de best bestudeerde doodsreceptoren (DRs) is CD95 (Fas, APO-1). De extrinsieke apoptotische route begint met de interactie van de DR met zijn verwante ligand, d.w.z. CD95L interageert met CD95 of TRAIL bindt aan TRAIL-R’s. Dit resulteert in de vorming van de DISC bij de overeenkomstige DR. DISC bestaat uit CD95, FADD, procaspase-8/-10 en c-FLIP eiwitten1,2. Bovendien wordt de DISC geassembleerd door interacties tussen death domain (DD)-bevattende eiwitten, zoals CD95 en FADD, en DED-bevattende eiwitten zoals FADD, procaspase-8/-10 en c-FLIP(Figuur 1). Procaspase-8 ondergaat oligomerisatie via associatie van zijn DED’s, wat resulteert in de vorming van DED-filamenten, gevolgd door procaspase-8 activering en verwerking. Dit veroorzaakt een caspase cascade, wat leidt tot celdood (Figuur 1)3,4. Procaspase-8 is dus een centrale initiator caspase van de extrinsieke apoptoseroute gemedieerd door CD95 of de TRAIL-R’s, geactiveerd op het overeenkomstige macromoleculaire platform, DISC.
Van twee isovormen van procaspase-8, namelijk procaspase-8a (p55) en -8b (p53), is bekend dat ze worden gerekruteerd voor de DISC5. Beide isovormen bestaan uit twee DED’s. DED1 en DED2 bevinden zich op het N-terminale deel van procaspase-8a/b gevolgd door de katalytische p18- en p10-domeinen. Gedetailleerde cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) analyse van procaspase-8 DEDs onthulde de assemblage van procaspase-8-eiwitten in filamenteuze structuren genaamd DED-filamenten4,6. Opmerkelijk genoeg werd aanvankelijk gesuggereerd dat de lineaire procaspase-8-ketens betrokken waren bij de dimerisatie gevolgd door procaspase-8-activering op de DISC. Nu is bekend dat die ketens slechts een onderbouw zijn van het procaspase-8 DED-filament, waarbij de laatste bestaat uit drie ketens geassembleerd tot een drievoudige helix3,4,6,7.
Bij dimerisatie bij het DED-filament leiden conformationele veranderingen in procaspase-8a/b tot de vorming van het actieve centrum van procaspase-8 en de activering ervan3,8. Dit wordt gevolgd door procaspase-8-verwerking, die via twee paden wordt gemedieerd: de eerste gaat via de generatie van een p43 / p41-splitsingsproduct en de tweede via de eerste generatie van een p30-splitsingsproduct. De p43/p41-route wordt geïnitieerd door de splitsing van procaspase-8a/b bij Asp374, wat resulteert in p43/p41- en p12-splitsingsproducten(figuur 2). Verder worden deze fragmenten autokatalytisch gesplitst bij Asp384 en Asp210/216, wat aanleiding geeft tot de vorming van het actieve caspase-8 heterotetrameer, p102/ p1829,10,11. Bovendien werd aangetoond dat parallel aan de p43/p41-verwerkingsroute procaspase-8a/b ook wordt gesplitst bij Asp216, wat leidt tot de vorming van het C-terminale splitsingsproduct p30, gevolgd door de proteolyse tot p10 en p1810 (figuur 2).
Procaspase-8a/b activering bij het DED filament wordt strikt gereguleerd door eiwitten genaamd c-FLIPs12. De c-FLIP-eiwitten komen voor in drie isovormen: c-FLIPLong (c-FLIPL),c-FLIPShort (c-FLIPS)en c-FLIPRaji (c-FLIPR). Alle drie de isovormen bevatten twee DED’s in hun N-terminale regio. c-FLIPL heeft ook een C-terminal katalytisch inactief caspase-achtig domein12,13. Beide korte isovormen van c-FLIP-c-FLIPS en c-FLIPRwerken op een anti-apoptotische manier door de vorming van DED-filamenten op de DISC6,14,15te verstoren. Bovendien kan c-FLIPL de activering van caspase-8 op een concentratieafhankelijke manier regelen. Dit kan resulteren in zowel pro- als anti-apoptotische effecten16,17,18. Door het katalytisch actieve procaspase-8/c-FLIPL heterodimeer te vormen, leidt c-FLIPL tot de stabilisatie van het actieve centrum van procaspase-8 en de activering ervan. De pro- of anti-apoptotische functie van c-FLIPL is direct afhankelijk van de hoeveelheid bij de DED-filamenten en de daaropvolgende hoeveelheid geassembleerde procaspase-8/c-FLIPL heterodimeren19. Lage of intermediaire concentraties c-FLIPL bij de DISC resulteren in voldoende hoeveelheden procaspase-8/c-FLIPL heterodimeren bij het DED-filament, wat de activering van caspase-8 ondersteunt. Daarentegen leiden verhoogde hoeveelheden c-FLIPL direct tot de anti-apoptotische effecten op de DISC20.
Alles bij elkaar genomen is de activering en verwerking van procaspase-8a/b bij de DISC een sterk gereguleerd proces dat verschillende stappen omvat. Dit artikel bespreekt de meting van procaspase-8-verwerking direct op de DISC en de analyse van de samenstelling van dit complex. Dit zal worden gepresenteerd met behulp van CD95 DISC als het voorbeeldige DR-complex.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze benadering werd voor het eerst beschreven door Kischkel et al.27 en is sindsdien met succes ontwikkeld door verschillende groepen. Verschillende belangrijke kwesties moeten worden overwogen voor efficiënte DISC-immunoprecipitatie en monitoring caspase-8-verwerking in dit complex.
Ten eerste is het essentieel om alle wasstappen tijdens immunoprecipitatie te volgen. Vooral belangrijk zijn de laatste wasstappen van de sepharose kralen en het drogen van de sepharose k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We erkennen de Wilhelm Sander-Foundation (2017.008.02), het Center of Dynamic Systems (CDS), gefinancierd door het EU-programma EFRO (European Regional Development Fund) en de DFG (LA 2386) voor het ondersteunen van ons werk. We bedanken Karina Guttek voor het ondersteunen van onze experimenten. We erkennen Prof. Dirk Reinhold (OvGU, Magdeburg) voor het leveren van primaire T-cellen.
Materials
| 12.5% SDS gel | self made | for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED |
|
| 14.5 cm cell dishes | Greiner | 639160 | |
| acrylamide | Carl Roth | A124.1 | |
| anti-actin Ab | Sigma Aldrich | A2103 | dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-APO-1 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo | ALX-805-038-C100 | used only for immunoprecipitation |
| anti-caspase-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-3 Ab | cell signaling | 9662 S | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-8 Ab C15 | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-242-C100 | dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-c-FLIP NF6 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-961-0100 | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-FADD 1C4 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ADI-AAM-212-E | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-PARP Ab | cell signaling | 9542 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| APS | Carl Roth | 9592.3 | |
| β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.2 | |
| Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml |
Bio Rad | 500-0006 | used according to manufacturer's instructions |
| CD95L | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-522-020-C005 | |
| chemoluminescence detector Chem Doc XRS+ |
Bio Rad | ||
| cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | prepared according to manufacturer's instructions |
| DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge |
| eletrophoresis buffer | self made | 10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage |
|
| glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Mouse IgG2b | SouthernBiotech | 1090-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Interleukin-2 Human(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | for activation of T cells |
| KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
| loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL |
Bio Rad | 161-0747 | prepared according to manufacturer's instructions |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUFO500 | |
| lysis buffer | self made | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O |
|
| medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium |
| medium for primary T cells | gibco by Life Technologie | 21875034 | adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium |
| milk powder | Carl Roth | T145.4 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| PBST | self made | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage |
|
| PBST + 5% milk | self made | 50 g milk powder + 1 L PBST | |
| PHA | Thermo Fisher Scientific | R30852801 | for actavation of T ells |
| Power Pac HC | Bio Rad | ||
| Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | use between 3-5 µL |
| Protein A Sepharose CL-4B beads | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions |
| scraper | VWR | 734-2602 | |
| SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
| shaker | Heidolph | ||
| sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer | Bio Rad | 10026938 | prepared according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
| Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |
References
- Lavrik, I. N., Krammer, P. H. Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC. Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).
- Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. Life and death in peripheral T cells. Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).
- Dickens, L. S., et al. A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death. Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).
- Fu, T. -. M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
- Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).
- Fox, J. L., et al. Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
- Schleich, K., et al. Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model. Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).
- Hughes, M. A., et al. Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival. Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).
- Lavrik, I., et al. The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2]. Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).
- Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation. Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).
- Golks, A., et al. The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation. Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).
- Oztürk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions. Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).
- Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).
- Hughes, M. A., et al. Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate. Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).
- Hillert, L. K., et al. Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly. Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).
- Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).
- Micheau, O., et al. The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).
- Chang, D. W., et al. C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis. EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).
- Hillert, L. K., et al. Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer. Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).
- Fricker, N., et al. Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL. Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).
- Arndt, B., et al. Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation. Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).
- Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network. Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).
- Schleich, K., et al. Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain. Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).
- Lavrik, I. N., et al. Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling. Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).
- Sprick, M. R., et al. Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8. EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).
- Neumann, L., et al. Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells. Molecular Systems Biology. 6 (1), 352 (2010).
- Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).
- Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways. Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).
- Kallenberger, S. M., et al. Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis. Science Signaling. 7 (316), 23 (2014).
