Medição da Composição do Complexo de Sinalização e Processamento de Indução de Morte CD95 de Procaspase-8 neste Complexo
Summary
Aqui, é apresentado um fluxo de trabalho experimental que permite a detecção do processamento caspase-8 diretamente no complexo de sinalização indutor de morte (DISC) e determina a composição desse complexo. Essa metodologia possui amplas aplicações, desde a desvendação dos mecanismos moleculares das vias de morte celular até a modelagem dinâmica das redes de apoptose.
Abstract
A apoptose extrínseca é mediada pela ativação de receptores de morte (DRs) como CD95/Fas/APO-1 ou ligante indutor de fator de necrose tumoral (TRAIL)-receptor 1/receptor 2 (TRAIL-R1/R2). A estimulação desses receptores com seus ligantes cognatos leva à montagem do complexo de sinalização indutor da morte (DISC). O DISCO compreende dr, a proteína adaptadora Fas com domínio de morte (FADD), procaspases-8/-10, e interleucina semelhante a FADD celular (IL)-1β-conversão de proteínas inibitórias de enzimas (c-FLIPs). O DISCO serve como uma plataforma para processamento e ativação procaspase-8. Este último ocorre por meio de sua dimerização/oligomerização nos filamentos de domínio de efeito de morte (DED) montados no DISC.
A ativação do procaspase-8 é seguida pelo seu processamento, que ocorre em várias etapas. Neste trabalho, descreve-se um fluxo de trabalho experimental estabelecido que permite a medição da formação de DISC e o processamento do procaspase-8 neste complexo. O fluxo de trabalho é baseado em técnicas de imunoprecipitação apoiadas pela análise de manchas ocidentais. Este fluxo de trabalho permite um monitoramento cuidadoso de diferentes etapas do recrutamento procaspase-8 para o DISCO e seu processamento e é altamente relevante para investigar mecanismos moleculares de apoptose extrínseca.
Introduction
Um dos receptores de morte (DRs) mais bem estudados é o CD95 (Fas, APO-1). A via poptótica extrínseca começa com a interação do DR com seu ligante cognato, ou seja, o CD95L interage com cd95 ou trail liga-Rs. Isso resulta na formação do DISCO no DR. DISC correspondente composto por CD95, FADD, procaspase-8/-10 e proteínas c-FLIP1,2. Além disso, o DISCO é montado por interações entre proteínas contendo domínio de morte (DD), como CD95 e FADD, e proteínas contendo DED, como FADD, procaspase-8/-10 e c-FLIP(Figura 1). O Procaspase-8 passa por oligomerização via associação de seus DEDs, resultando na formação de filamentos de DED, seguido pela ativação e processamento do Procaspase-8. Isso desencadeia uma cascata de caspase, que leva à morte celular(Figura 1)3,4. Assim, o procaspase-8 é um caspase iniciador central da via de apoptose extrínseca mediada por CD95 ou trail-Rs, ativada na plataforma macromolecular correspondente, DISC.
Dois isóformes de procaspase-8, ou seja, procaspase-8a (p55) e -8b (p53), são conhecidos por serem recrutados para o DISC5. Ambas as isoformas compreendem dois DEDs. DED1 e DED2 estão localizados na parte n-terminal do procaspase-8a/b seguido pelos domínios catalíticos p18 e p10. A análise detalhada da microscopia crio-elétron (crio-EM) dos DEDs procaspase-8 revelou a montagem de proteínas procaspase-8 em estruturas filamentos filamentos de ded chamados filamentos DED4,6. Notavelmente, as cadeias lineares procaspase-8 foram inicialmente sugeridas para serem engajadas na dimerização seguida pela ativação procaspase-8 no DISC. Agora, sabe-se que essas cadeias são apenas uma subestrutura do filamento procaspase-8 DED, este último compreendendo três cadeias montadas em uma tríplice hélice3,4,6,7.
Após a dimerização no filamento de DED, alterações conformais no procaspase-8a/b levam à formação do centro ativo do procaspase-8 e sua ativação3,8. Isso é seguido pelo processamento procaspase-8, que é mediado por duas vias: a primeira passa pela geração de um produto de decote p43/p41 e a segunda através da geração inicial de um produto de decote p30. A via p43/p41 é iniciada pelo decote de procaspase-8a/b em Asp374, resultando em produtos de decote p43/p41 e p12(Figura 2). Além disso, esses fragmentos são auto-catalicamente cortados em Asp384 e Asp210/216, dando origem à formação do heterotetramer caspase ativo-8, p102/p1829,10,11. Além disso, mostrou-se que paralelamente à via p43/p41 de processamento, o procaspase-8a/b também é cortado em Asp216, o que leva à formação do produto de decote terminal C p30, seguido por sua proteólise para p10 e p1810 (Figura 2).
A ativação procaspase-8a/b no filamento DED é estritamente regulada por proteínas chamadas c-FLIPs12. As proteínas c-FLIP ocorrem em três isoformas: c-FLIPLong (c-FLIPL),c-FLIPShort (c-FLIPS)e c-FLIPRaji (c-FLIPR). Todos os três isoforms contêm dois DEDs em sua região n-terminal. c-FLIPL também possui um terminal C catalyticamente inativo como o domínio caspase12,13. Ambos os isoformes curtos de c-FLIP-c-FLIPS e c-FLIPR-ajam de forma anti-apoptótica interrompendo a formação de filamento de DED no DISC6,14,15. Além disso, o C-FLIPL pode regular a ativação caspase-8 de forma dependente da concentração. Isso pode resultar em efeitos pró e anti-apoptóticos16,17,18. Ao formar o catalisticamente ativo procaspase-8/c-FLIPL heterodimer, c-FLIPL leva à estabilização do centro ativo do procaspase-8 e sua ativação. A função pró ou anti-apoptótica do c-FLIPL depende diretamente de sua quantidade nos filamentos de DED e da quantidade subsequente de heterímeros procaspase-8/c-FLIPL 19. Concentrações baixas ou intermediárias de c-FLIPL no DISCO resultam em quantidades suficientes de heterodimers procaspase-8/c-FLIPL no filamento DED, que suporta a ativação de caspase-8. Em contraste, o aumento das quantidades de c-FLIPL levam diretamente aos seus efeitos anti-apoptóticos no DISC20.
Em conjunto, a ativação e processamento do procaspase-8a/b no DISCO é um processo altamente regulamentado envolvendo várias etapas. Este artigo discute a medição do processamento procaspase-8 diretamente no DISCO, bem como a análise da composição deste complexo. Este será apresentado utilizando o CD95 DISC como o complexo dr exemplar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esta abordagem foi descrita pela primeira vez por Kischkel et al.27 e foi desenvolvida com sucesso desde então por vários grupos. Várias questões importantes devem ser consideradas para a eficiente imunoprecipitação disc-imunoprecipitação e monitoramento do processamento caspase-8 neste complexo.
Em primeiro lugar, é essencial seguir todas as etapas de lavagem durante a imunoprecipitação. Especialmente importantes são as etapas finais de lavagem das contas d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos a Wilhelm Sander-Foundation (2017.008.02), o Centro de Sistemas Dinâmicos (CDS), financiado pelo Programa EUROPEU ERDF (European Regional Development Fund) e o DFG (LA 2386) por apoiar nosso trabalho. Agradecemos a Karina Guttek por apoiar nossas experiências. Reconhecemos o Prof. Dirk Reinhold (OvGU, Magdeburg) por nos fornecer células T primárias.
Materials
| 12.5% SDS gel | self made | for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED |
|
| 14.5 cm cell dishes | Greiner | 639160 | |
| acrylamide | Carl Roth | A124.1 | |
| anti-actin Ab | Sigma Aldrich | A2103 | dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-APO-1 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo | ALX-805-038-C100 | used only for immunoprecipitation |
| anti-caspase-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-3 Ab | cell signaling | 9662 S | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-8 Ab C15 | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-242-C100 | dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-c-FLIP NF6 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-961-0100 | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-FADD 1C4 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ADI-AAM-212-E | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-PARP Ab | cell signaling | 9542 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| APS | Carl Roth | 9592.3 | |
| β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.2 | |
| Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml |
Bio Rad | 500-0006 | used according to manufacturer's instructions |
| CD95L | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-522-020-C005 | |
| chemoluminescence detector Chem Doc XRS+ |
Bio Rad | ||
| cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | prepared according to manufacturer's instructions |
| DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge |
| eletrophoresis buffer | self made | 10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage |
|
| glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Mouse IgG2b | SouthernBiotech | 1090-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Interleukin-2 Human(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | for activation of T cells |
| KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
| loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL |
Bio Rad | 161-0747 | prepared according to manufacturer's instructions |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUFO500 | |
| lysis buffer | self made | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O |
|
| medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium |
| medium for primary T cells | gibco by Life Technologie | 21875034 | adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium |
| milk powder | Carl Roth | T145.4 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| PBST | self made | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage |
|
| PBST + 5% milk | self made | 50 g milk powder + 1 L PBST | |
| PHA | Thermo Fisher Scientific | R30852801 | for actavation of T ells |
| Power Pac HC | Bio Rad | ||
| Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | use between 3-5 µL |
| Protein A Sepharose CL-4B beads | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions |
| scraper | VWR | 734-2602 | |
| SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
| shaker | Heidolph | ||
| sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer | Bio Rad | 10026938 | prepared according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
| Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |
References
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