Måling sammensætning af CD95 Death-inducerende signalering kompleks og behandling af Procaspase-8 i dette kompleks
Summary
Her præsenteres en eksperimentel arbejdsgang, der muliggør påvisning af caspase-8-behandling direkte ved det dødsfremkaldende signalkompleks (DISC) og bestemmer sammensætningen af dette kompleks. Denne metode har brede anvendelser, fra optrævling af de molekylære mekanismer i celledødsveje til dynamisk modellering af apoptosenetværk.
Abstract
Ekstrinsisk apoptose medieres ved aktivering af dødsreceptorer (DRs) såsom CD95/Fas/APO-1 eller tumornekrosefaktorrelateret apoptosefremkaldende ligand (TRAIL)-receptor 1/receptor 2 (TRAIL-R1/R2). Stimulering af disse receptorer med deres cognate ligands fører til samlingen af det dødsfremkaldende signalkompleks (DISC). DISC består af DR, adapterproteinet Fas-associeret protein med dødsdomæne (FADD), prokapaser-8/-10 og cellulær FADD-lignende interleukin (IL)-1β-konvertering af enzymhæmningstrumende proteiner (c-FLIPs). DISC fungerer som en platform for procaspase-8 behandling og aktivering. Sidstnævnte sker via sin dimerization /oligomerisering i død effector domæne (DED) filamenter samlet på DISC.
Aktivering af procaspase-8 efterfølges af dens behandling, som forekommer i flere trin. I dette arbejde beskrives en etableret eksperimentel arbejdsgang, der gør det muligt at måle DISC-dannelse og behandling af procaspase-8 i dette kompleks. Arbejdsgangen er baseret på immunprecipitation teknikker understøttes af vestlige blot analyse. Denne arbejdsgang giver mulighed for omhyggelig overvågning af forskellige trin i procaspase-8 rekruttering til DISC og dens behandling og er yderst relevant for at undersøge molekylære mekanismer af extrinsisk apoptose.
Introduction
En af de bedst studerede død receptorer (DRs) er CD95 (Fas, APO-1). Den ydre apoptotiske vej starter med DR’s interaktion med dens cognate ligand, dvs. CD95L interagerer med CD95 eller TRAIL binder sig til TRAIL-Rs. Dette resulterer i dannelsen af DISC på den tilsvarende DR. DISC består af CD95, FADD, procaspase-8/-10, og c-FLIP proteiner1,2. Desuden samles DISC’en ved interaktioner mellem dødsdomæne (DD)-holdige proteiner, såsom CD95 og FADD, og DED-holdige proteiner som FADD, procaspase-8/-10 og c-FLIP (Figur 1). Procaspase-8 gennemgår oligomerisering via sammenslutningen af sine DED’er, hvilket resulterer i dannelsen af DED filamenter, efterfulgt af procaspase-8 aktivering og behandling. Dette udløser en caspase kaskade, som fører til celledød (Figur 1)3,4. Procaspase-8 er således en central initiator caspase af den ydre apoptosevej, der er medieret af CD95 eller TRAIL-R’erne, aktiveret på den tilsvarende makromoekylær platform, DISC.
To isoforme procaspase-8, nemlig procaspase-8a (p55) og -8b (p53), er kendt for at blive rekrutteret til DISC5. Begge isoformer består af to DED’er. DED1 og DED2 er placeret på N-terminal del af procaspase-8a/b efterfulgt af katalytiske p18 og p10 domæner. Detaljeret kryo-elektronmikroskopi (kryo-EM) analyse af procaspase-8 DEDs afslørede samlingen af procaspase-8 proteiner i filamentøse strukturer kaldet DED filamenter4,6. Bemærkelsesværdigt, den lineære procaspase-8 kæder blev oprindeligt foreslået at være involveret i dimerization efterfulgt af procaspase-8 aktivering på DISC. Nu er det kendt, at disse kæder kun er en understruktur af procaspase-8 DED glødetråd, sidstnævnte bestående af tre kæder samlet i en tredobbelt helix3,4,6,7.
Ved dimerisering ved DED-glødetråden fører kropslige ændringer i procaspase-8a/b til dannelsen af det aktive center for procaspase-8 og dets aktivering3,8. Dette efterfølges af procaspase-8 behandling, som medieres via to veje: den første går via generering af et p43/p41 kavalergangsprodukt og det andet via den første generation af et p30 kavalergangsprodukt. P43/p41-stien indledes ved kavalergang af procaspase-8a/b ved Asp374, hvilket resulterer i p43/p41 og p12 kavalergangsprodukter (figur 2). Desuden er disse fragmenter automatisk katalytisk kløvet ved Asp384 og Asp210/216, hvilket giver anledning til dannelsen af den aktive caspase-8 heterotetramer, p102/ p1829,10,11. Derudover blev det påvist, at procaspase-8a/b parallelt med p43/p41-forarbejdningsvejen også spaltes ved Asp216, hvilket fører til dannelsen af C-terminal kavalergangsproduktet p30, efterfulgt af dets proteolyse til p10 og p1810 (figur 2).
Procaspase-8a/b aktivering ved DED glødetråd er strengt reguleret af proteiner ved navn c-FLIPs12. C-FLIP-proteinerne forekommer i tre isoformer: c-FLIPLong (c-FLIPL), c-FLIPShort (c-FLIPS)og c-FLIPRaji (c-FLIPR). Alle tre isoformer indeholder to DED’er i deres N-terminal-område. c-FLIPL har også en C-terminal katalytisk inaktiv caspase-lignende domæne12,13. Både korte isoforme af c-FLIP-c-FLIPS og c-FLIPR-virker på en anti-apoptotisk måde ved at forstyrre DED glødetråd dannelse på DISC6,14,15. Derudover kan c-FLIPL regulere caspase-8 aktivering på en koncentrationsafhængig måde. Dette kan resultere i både pro- og antiapptotiske virkninger16,17,18. Ved at danne den katalytisk aktive procaspase-8/c-FLIPL heterodimer fører c-FLIPL til stabilisering af det aktive centrum af procaspase-8 og dets aktivering. C-FLIPL’s pro- eller antiapptotiske funktion afhænger direkte af dens mængde ved DED-filamenter og den efterfølgende mængde samlede procaspase-8/c-FLIP L-heterodimers 19. Lave eller mellemliggende koncentrationer af c-FLIPL ved DISC resulterer i tilstrækkelige mængder procaspase-8/c-FLIP L-heterodimerer ved DED-glødetråden, som understøtter aktiveringen af caspase-8. I modsætning hertil fører øgede mængder c-FLIPL direkte til dets antiapptotiske virkninger på DISC20.
Samlet set er aktivering og behandling af procaspase-8a/b på DISC en stærkt reguleret proces, der involverer flere trin. Dette papir diskuterer måling af procaspase-8 behandling direkte på DISC samt analysen af sammensætningen af dette kompleks. Dette vil blive præsenteret ved hjælp af CD95 DISC som det eksemplariske DR-kompleks.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne fremgangsmåde blev først beskrevet af Kischkel et al.27 og er med succes blevet udviklet siden da af flere grupper. Flere vigtige spørgsmål skal overvejes for effektiv DISC-immunprecipitation og overvågning caspase-8 behandling i dette kompleks.
For det første er det vigtigt at følge alle vasketrin under immunprecipitation. Særligt vigtigt er de sidste vasketrin af sepharose perler og tørring af sepharose perler. Dette skal gøres korrekt for at øge sign…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender Wilhelm Sander-Foundation (2017.008.02), Center of Dynamic Systems (CDS), finansieret af EU-programmet EFRU (Den Europæiske Fond for Regionaludvikling) og DFG (LA 2386) for at støtte vores arbejde. Vi takker Karina Guttek for at støtte vores eksperimenter. Vi anerkender Prof. Dirk Reinhold (OvGU, Magdeburg) for at give os primære T-celler.
Materials
| 12.5% SDS gel | self made | for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED |
|
| 14.5 cm cell dishes | Greiner | 639160 | |
| acrylamide | Carl Roth | A124.1 | |
| anti-actin Ab | Sigma Aldrich | A2103 | dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-APO-1 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo | ALX-805-038-C100 | used only for immunoprecipitation |
| anti-caspase-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-3 Ab | cell signaling | 9662 S | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-8 Ab C15 | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-242-C100 | dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-c-FLIP NF6 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-961-0100 | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-FADD 1C4 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ADI-AAM-212-E | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-PARP Ab | cell signaling | 9542 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| APS | Carl Roth | 9592.3 | |
| β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.2 | |
| Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml |
Bio Rad | 500-0006 | used according to manufacturer's instructions |
| CD95L | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-522-020-C005 | |
| chemoluminescence detector Chem Doc XRS+ |
Bio Rad | ||
| cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | prepared according to manufacturer's instructions |
| DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge |
| eletrophoresis buffer | self made | 10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage |
|
| glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Mouse IgG2b | SouthernBiotech | 1090-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Interleukin-2 Human(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | for activation of T cells |
| KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
| loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL |
Bio Rad | 161-0747 | prepared according to manufacturer's instructions |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUFO500 | |
| lysis buffer | self made | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O |
|
| medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium |
| medium for primary T cells | gibco by Life Technologie | 21875034 | adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium |
| milk powder | Carl Roth | T145.4 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| PBST | self made | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage |
|
| PBST + 5% milk | self made | 50 g milk powder + 1 L PBST | |
| PHA | Thermo Fisher Scientific | R30852801 | for actavation of T ells |
| Power Pac HC | Bio Rad | ||
| Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | use between 3-5 µL |
| Protein A Sepharose CL-4B beads | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions |
| scraper | VWR | 734-2602 | |
| SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
| shaker | Heidolph | ||
| sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer | Bio Rad | 10026938 | prepared according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
| Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |
References
- Lavrik, I. N., Krammer, P. H. Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC. Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).
- Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. Life and death in peripheral T cells. Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).
- Dickens, L. S., et al. A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death. Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).
- Fu, T. -. M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
- Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).
- Fox, J. L., et al. Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
- Schleich, K., et al. Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model. Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).
- Hughes, M. A., et al. Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival. Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).
- Lavrik, I., et al. The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2]. Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).
- Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation. Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).
- Golks, A., et al. The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation. Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).
- Oztürk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions. Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).
- Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).
- Hughes, M. A., et al. Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate. Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).
- Hillert, L. K., et al. Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly. Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).
- Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).
- Micheau, O., et al. The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).
- Chang, D. W., et al. C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis. EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).
- Hillert, L. K., et al. Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer. Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).
- Fricker, N., et al. Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL. Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).
- Arndt, B., et al. Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation. Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).
- Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network. Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).
- Schleich, K., et al. Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain. Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).
- Lavrik, I. N., et al. Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling. Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).
- Sprick, M. R., et al. Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8. EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).
- Neumann, L., et al. Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells. Molecular Systems Biology. 6 (1), 352 (2010).
- Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).
- Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways. Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).
- Kallenberger, S. M., et al. Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis. Science Signaling. 7 (316), 23 (2014).
