CD95 मौत उत्प्रेरण सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स की संरचना को मापना और इस परिसर में Procaspase-8 का प्रसंस्करण
Summary
यहां, एक प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो प्रस्तुत किया गया है जो सीधे मृत्यु-उत्प्रेरण सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स (डिस्क) पर सीधे -8 प्रसंस्करण का पता लगाने में सक्षम बनाता है और इस परिसर की संरचना को निर्धारित करता है। इस पद्धति में व्यापक अनुप्रयोग हैं, एपोप्टोसिस नेटवर्क के गतिशील मॉडलिंग के लिए सेल मृत्यु मार्गों के आणविक तंत्र को उजागर करने से।
Abstract
बाह्य एपोप्टोसिस को मृत्यु रिसेप्टर्स (डीआर) जैसे कि सीडी 95 / फास / एपीओ -1 या ट्यूमर नेक्रोसिस कारक से संबंधित एपोप्टोसिस-उत्प्रेरण लिगैंड (ट्रेल) – रिसेप्टर 1 / रिसेप्टर 2 (ट्रेल-आर 1 / आर 2) के सक्रियण द्वारा मध्यस्थता की जाती है। उनके संज्ञानात्मक लिगेंड के साथ इन रिसेप्टर्स की उत्तेजना मृत्यु-उत्प्रेरण सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स (डिस्क) की असेंबली की ओर ले जाती है। DISC में DR, adaptor protein Fas-associated protein with death domain (FADD), procaspases-8/-10, और cellular FADD-like interleukin (IL)-1π-converting enzyme-inhibitory proteins (c-FLIPs) शामिल हैं। DISC procaspase-8 प्रसंस्करण और सक्रियण के लिए एक मंच के रूप में कार्य करता है। उत्तरार्द्ध डिस्क पर इकट्ठे हुए मृत्यु प्रभावक डोमेन (डीईडी) फिलामेंट्स में इसके डिमराइजेशन / ओलिगोमेराइजेशन के माध्यम से होता है।
प्रोकैस्पेज़ -8 के सक्रियण के बाद इसकी प्रसंस्करण होती है, जो कई चरणों में होती है। इस काम में, एक स्थापित प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो का वर्णन किया गया है जो DISC गठन के माप और इस परिसर में procaspase-8 के प्रसंस्करण की अनुमति देता है। वर्कफ़्लो पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा समर्थित immunoprecipitation तकनीकों पर आधारित है। यह वर्कफ़्लो डिस्क और इसके प्रसंस्करण के लिए procaspase-8 भर्ती के विभिन्न चरणों की सावधानीपूर्वक निगरानी की अनुमति देता है और बाहरी एपोप्टोसिस के आणविक तंत्र की जांच के लिए अत्यधिक प्रासंगिक है।
Introduction
सबसे अच्छी तरह से अध्ययन किए गए मृत्यु रिसेप्टर्स (डीआर) में से एक सीडी 95 (फास, एपीओ -1) है। बाह्य एपोप्टोटिक मार्ग अपने संज्ञेय लिगैंड के साथ डीआर की बातचीत के साथ शुरू होता है, यानी, सीडी 9 5 एल सीडी 9 5 के साथ बातचीत करता है या ट्रेल ट्रेल-रुपये से बांधता है। इसके परिणामस्वरूप संबंधित DR पर DISC का निर्माण होता है। DISC में CD95, FADD, procaspase-8/-10, और c-FLIP प्रोटीन1,2होते हैं। इसके अलावा, डिस्क को मृत्यु डोमेन (डीडी) के बीच बातचीत द्वारा इकट्ठा किया जाता है – प्रोटीन युक्त प्रोटीन, जैसे कि सीडी 9 5 और एफएडीडी, और डीईडी-युक्त प्रोटीन जैसे एफएडीडी, प्रोकैस्पेज -8 / -10, और सी-फ्लिप(चित्रा 1)। Procaspase-8 अपने DEDs के संघ के माध्यम से oligomerization से गुजरता है, जिसके परिणामस्वरूप DED फिलामेंट्स का गठन होता है, जिसके बाद procaspase-8 सक्रियण और प्रसंस्करण होता है। यह एक कैस्केड को ट्रिगर करता है, जो सेल की मृत्यु की ओर जाता है(चित्रा 1)3,4। इस प्रकार, procaspase-8 CD95 या TRAIL-Rs द्वारा मध्यस्थता किए गए बाह्य एपोप्टोसिस मार्ग का एक केंद्रीय प्रारंभकर्ता है, जो संबंधित मैक्रोमोलेक्यूलर प्लेटफ़ॉर्म, डिस्क पर सक्रिय है।
procaspase-8 के दो आइसोफॉर्म, अर्थात् procaspase-8a (p55) और -8b (p53), DISC5में भर्ती होने के लिए जाने जाते हैं। दोनों आइसोफॉर्म में दो डीईडी शामिल हैं। DED1 और DED2 procaspase-8a/b के N-टर्मिनल भाग पर स्थित हैं, जिसके बाद उत्प्रेरक p18 और p10 डोमेन हैं। प्रोकैस्पेज़-8 डीईडी के विस्तृत क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) विश्लेषण से पता चला कि डीईडी फिलामेंट्स4,6नामक फिलामेंटस संरचनाओं में प्रोकैस्पेज़-8प्रोटीन की असेंबली का पता चला है। उल्लेखनीय रूप से, रैखिक procaspase-8 श्रृंखलाओं को शुरू में DISC पर procaspase-8 सक्रियण के बाद dimerization में लगे होने का सुझाव दिया गया था। अब, यह ज्ञात है कि वे श्रृंखलाएं केवल प्रोकैस्पेज़ -8 डीईडी फिलामेंट की एक उप-संरचना हैं, उत्तरार्द्ध में तीन श्रृंखलाएं शामिल हैं जो ट्रिपल हेलिक्स3,4,6,7में इकट्ठी होती हैं।
डीईडी फिलामेंट पर dimerization पर, procaspase-8a / b में संरचनात्मक परिवर्तन procaspase-8 के सक्रिय केंद्र के गठन और इसके सक्रियण3,8के गठन के लिए नेतृत्व करते हैं। इसके बाद प्रोकैस्पेज़ -8 प्रसंस्करण होता है, जिसे दो मार्गों के माध्यम से मध्यस्थता की जाती है: पहला एक p43 / p41 दरार उत्पाद की पीढ़ी के माध्यम से जाता है और दूसरा एक p30 दरार उत्पाद की प्रारंभिक पीढ़ी के माध्यम से जाता है। P43/p41 मार्ग Asp374 पर procaspase-8a/b की दरार द्वारा शुरू किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप p43/p41 और p12 दरार उत्पाद(चित्रा 2)। इसके अलावा, इन टुकड़ों को Asp384 और Asp210/216 पर ऑटो-उत्प्रेरक रूप से क्लीव किया जाता है, जिससे सक्रिय-8 हेटरोटेट्रेमर, p10 2 /p1829,10,11के गठन को जन्म मिलता है। इसके अलावा, यह दिखाया गया था कि प्रसंस्करण के p43 / p41 मार्ग के समानांतर, procaspase-8a / b को Asp216 पर भी क्लीव किया जाता है, जो सी-टर्मिनल क्लीवेज उत्पाद p30 के गठन की ओर जाता है, इसके बाद p10 और p1810 (चित्रा 2)के लिए इसके proteolysis द्वारा पीछा किया जाता है।
DED फिलामेंट पर Procaspase-8a/b सक्रियण को c-FLIPs12नामक प्रोटीन द्वारा सख्ती से विनियमित किया जाता है। C-FLIP प्रोटीन तीन isoforms में होते हैं: c-FLIPLong (c-FLIPL),c-FLIPShort (c-FLIPS),और c-FLIPRaji (c-FLIPR)। सभी तीन आइसोफॉर्मों में उनके एन-टर्मिनल क्षेत्र में दो डीईडी होते हैं। c-FLIPL में एक C-terminal catalytically inactive-like domain12,13भी होता है। C-FLIP-c-FLIPS और c-FLIPRके दोनों छोटे आइसोफॉर्म्स डिस्क6,14, 15पर DED फिलामेंट गठन को बाधित करके एंटी-एपोप्टोटिक तरीके से कार्य करतेहैं। इसके अलावा, सी-फ्लिपएल एक एकाग्रता-निर्भर तरीके से सक्रियण को विनियमित कर सकता है। इसके परिणामस्वरूप प्रो- और एंटी-एपोप्टोटिक प्रभाव16 , 17,18दोनों हो सकतेहैं। उत्प्रेरक रूप से सक्रिय procaspase-8/c-FLIPL heterodimer बनाने से, c-FLIPL procaspase-8 के सक्रिय केंद्र के स्थिरीकरण और इसके सक्रियण की ओर जाता है। C-FLIPL का प्रो- या एंटी-एपोप्टोटिक फ़ंक्शन सीधे DED फिलामेंट्स पर इसकी मात्रा पर निर्भर करता है और इकट्ठे हुए procaspase-8/c-FLIPL heterodimers19की बाद की मात्रा पर निर्भर करता है। डिस्क पर सी-फ्लिपएल की कम या मध्यवर्ती सांद्रता के परिणामस्वरूप डीईडी फिलामेंट पर प्रोकैस्पेज़ -8 / सी-फ्लिपएल हेटरोडिमर्स की पर्याप्त मात्रा होती है, जो कि 8 के सक्रियण का समर्थन करता है। इसके विपरीत, सी-फ्लिपएल की बढ़ी हुई मात्रा सीधे डिस्क20पर इसके एंटी-एपोप्टोटिक प्रभावों का कारण बनती है।
एक साथ लिया गया, DISC पर procaspase-8a/b का सक्रियण और प्रसंस्करण एक अत्यधिक विनियमित प्रक्रिया है जिसमें कई चरण शामिल हैं। यह पेपर डिस्क पर सीधे प्रोकैस्पेज़ -8 प्रसंस्करण के माप के साथ-साथ इस परिसर की संरचना के विश्लेषण पर चर्चा करता है। यह अनुकरणीय DR परिसर के रूप में CD95 DISC का उपयोग कर प्रस्तुत किया जाएगा।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस दृष्टिकोण को पहली बार Kischkel et al.27 द्वारा वर्णित किया गया था और तब से कई समूहों द्वारा सफलतापूर्वक विकसित किया गया है। इस परिसर में कुशल DISC-immunoprecipitation और निगरानी के लिए कई महत्वपूर्ण मुद्दों पर विचार…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम विल्हेम सैंडर-फाउंडेशन (2017.008.02), सेंटर ऑफ डायनेमिक सिस्टम्स (सीडीएस) को स्वीकार करते हैं, जो यूरोपीय संघ-कार्यक्रम ईआरडीएफ (यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष) और डीएफजी (एलए 2386) द्वारा हमारे काम का समर्थन करने के लिए वित्त पोषित है। हम हमारे प्रयोगों का समर्थन करने के लिए करीना गुटटेक को धन्यवाद देते हैं। हम प्रोफेसर डिर्क रेनहोल्ड (OvGU, Magdeburg) को हमें प्राथमिक टी कोशिकाएं प्रदान करने के लिए स्वीकार करते हैं।
Materials
| 12.5% SDS gel | self made | for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED |
|
| 14.5 cm cell dishes | Greiner | 639160 | |
| acrylamide | Carl Roth | A124.1 | |
| anti-actin Ab | Sigma Aldrich | A2103 | dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-APO-1 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo | ALX-805-038-C100 | used only for immunoprecipitation |
| anti-caspase-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-3 Ab | cell signaling | 9662 S | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-8 Ab C15 | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-242-C100 | dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-c-FLIP NF6 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-961-0100 | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-FADD 1C4 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ADI-AAM-212-E | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-PARP Ab | cell signaling | 9542 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| APS | Carl Roth | 9592.3 | |
| β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.2 | |
| Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml |
Bio Rad | 500-0006 | used according to manufacturer's instructions |
| CD95L | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-522-020-C005 | |
| chemoluminescence detector Chem Doc XRS+ |
Bio Rad | ||
| cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | prepared according to manufacturer's instructions |
| DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge |
| eletrophoresis buffer | self made | 10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage |
|
| glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Mouse IgG2b | SouthernBiotech | 1090-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Interleukin-2 Human(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | for activation of T cells |
| KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
| loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL |
Bio Rad | 161-0747 | prepared according to manufacturer's instructions |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUFO500 | |
| lysis buffer | self made | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O |
|
| medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium |
| medium for primary T cells | gibco by Life Technologie | 21875034 | adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium |
| milk powder | Carl Roth | T145.4 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| PBST | self made | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage |
|
| PBST + 5% milk | self made | 50 g milk powder + 1 L PBST | |
| PHA | Thermo Fisher Scientific | R30852801 | for actavation of T ells |
| Power Pac HC | Bio Rad | ||
| Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | use between 3-5 µL |
| Protein A Sepharose CL-4B beads | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions |
| scraper | VWR | 734-2602 | |
| SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
| shaker | Heidolph | ||
| sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer | Bio Rad | 10026938 | prepared according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
| Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |
References
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