Her presenteres en eksperimentell arbeidsflyt som muliggjør deteksjon av caspase-8-behandling direkte ved det dødsinduserende signalkomplekset (DISC) og bestemmer sammensetningen av dette komplekset. Denne metodikken har brede anvendelser, fra å avdekke molekylære mekanismer for celledødsveier til dynamisk modellering av apoptosenettverk.
Ekstrinsisk apoptose formidles ved aktivering av dødsreseptorer (DRs) som CD95/Fas/APO-1 eller tumornekrosefaktorrelatert apoptoseinduserende ligand (TRAIL)-reseptor 1/reseptor 2 (TRAIL-R1/R2). Stimulering av disse reseptorene med deres cognate ligander fører til montering av dødsinduserende signalkompleks (DISC). DISC består av DR, adapterproteinet Fas-assosiert protein med dødsdomene (FADD), procaspases-8/-10 og cellulære FADD-lignende interleukin (IL)-1β-konverterende enzymhemmende proteiner (c-FLIPer). DISC fungerer som en plattform for procaspase-8-behandling og aktivering. Sistnevnte skjer via dimerisering/oligomerisering i dødseffektordomenet (DED) filamenter samlet på DISC.
Aktivering av procaspase-8 etterfølges av behandlingen, som skjer i flere trinn. I dette arbeidet beskrives en etablert eksperimentell arbeidsflyt som tillater måling av DISC-dannelse og behandling av procaspase-8 i dette komplekset. Arbeidsflyten er basert på immunoprecipitation teknikker støttet av vestlige blot analyse. Denne arbeidsflyten tillater nøye overvåking av ulike trinn i procaspase-8 rekruttering til DISC og dens behandling og er svært relevant for å undersøke molekylære mekanismer for ekstrinsisk apoptose.
En av de best studerte dødsreseptorene (DRs) er CD95 (Fas, APO-1). Den ekstrinsiske apoptotiske banen starter med samspillet mellom DR og konjakkligaden, det vil si at CD95L samhandler med CD95 eller TRAIL binder seg til TRAIL-Rs. Dette resulterer i dannelsen av DISC ved tilsvarende DR. DISC består av CD95, FADD, procaspase-8/-10 og c-FLIP proteiner1,2. Videre er DISC montert ved interaksjoner mellom dødsdomene (DD)-inneholdende proteiner, for eksempel CD95 og FADD, og DED-inneholdende proteiner som FADD, procaspase-8/-10 og c-FLIP (Figur 1). Procaspase-8 gjennomgår oligomerisering via assosiasjon av sine DED-er, noe som resulterer i dannelse av DED-filamenter, etterfulgt av procaspase-8 aktivering og behandling. Dette utløser en kaspasekaskade, som fører til celledød (Figur 1)3,4. Dermed er procaspase-8 en sentral initiator caspase av den ekstrinsiske apoptosebanen mediert av CD95 eller TRAIL-Rs, aktivert på den tilsvarende makromolekylære plattformen, DISC.
To isoformer av procaspase-8, nemlig procaspase-8a (p55) og -8b (p53), er kjent for å bli rekruttert til DISC5. Begge isoformene består av to DED-er. DED1 og DED2 er plassert på N-terminaldelen av procaspase-8a/b etterfulgt av katalytiske p18- og p10-domener. Detaljert kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) analyse av procaspase-8 DEDs avslørte montering av procaspase-8 proteiner i filamentøse strukturer kalt DED filamenter4,6. Bemerkelsesverdig nok ble de lineære procaspase-8-kjedene opprinnelig foreslått å være engasjert i dimeriseringen etterfulgt av procaspase-8-aktivering ved DISC. Nå er det kjent at disse kjedene bare er en understruktur av procaspase-8 DED-filamentet, sistnevnte består av tre kjeder samlet i en trippel helix3,4,6,7.
Ved dimerisering ved DED-filamentet fører konformasjonsendringer i procaspase-8a/b til dannelsen av det aktive sentrum av procaspase-8 ogaktiveringen 3,8. Dette etterfølges av procaspase-8-behandling, som formidles via to veier: den første går via genereringen av et p43 / p41 spaltingsprodukt og den andre via den første generasjonen av et p30 spaltingsprodukt. p43/p41-banen initieres av spaltingen av procaspase-8a/b ved Asp374, noe som resulterer i p43/p41- og p12-spaltingsprodukter (Figur 2). Videre er disse fragmentene automatisk katalytisk spaltet på Asp384 og Asp210/216, noe som gir opphav til dannelsen av den aktive caspase-8 heterotetramer, p102/p1829,10,11. I tillegg ble det vist at parallelt med p43/p41-behandlingsforløpet, er procaspase-8a/b også spaltet på Asp216, noe som fører til dannelsen av C-terminal spaltingsproduktet p30, etterfulgt av proteolyse til p10 og p1810 (Figur 2).
Procaspase-8a/b-aktivering ved DED-filamentet er strengt regulert av proteiner kalt c-FLIPer12. c-FLIP-proteinene forekommer i tre isoformer: c-FLIPLong (c-FLIPL), c-FLIPShort (c-FLIPS) og c-FLIPRaji (c-FLIPR). Alle tre isoformene inneholder to DED-er i N-terminalområdet. c-FLIPL har også et C-terminal katalytisk inaktivt caspase-lignende domene12,13. Både korte isoformer av c-FLIP-c-FLIPS og c-FLIPR-virker på en anti-apoptotisk måte ved å forstyrre DED-filamentformasjonen ved DISC6,14,15. I tillegg kan c-FLIPL regulere caspase-8-aktivering på en konsentrasjonsavhengig måte. Dette kan resultere i både pro- og anti-apoptotiske effekter16,17,18. Ved å danne den katalytisk aktive procaspase-8/c-FLIP L-heterodimeren, fører c-FLIPL til stabilisering av det aktive sentrum av procaspase-8 og aktiveringen. Den pro- eller anti-apoptotiske funksjonen til c-FLIPL er direkte avhengig av mengden ved DED-filamentene og den påfølgende mengden montert procaspase-8/c-FLIPL heterodimers19. Lave eller mellomliggende konsentrasjoner av c-FLIPL ved DISC resulterer i tilstrekkelige mengder procaspase-8/c-FLIP L-heterodimere ved DED-filamentet, som støtter aktivering av caspase-8. I motsetning fører økte mengder c-FLIPL direkte til sine anti-apoptotiske effekter ved DISC20.
Samlet sett er aktivering og behandling av procaspase-8a/b på DISC en svært regulert prosess som involverer flere trinn. Dette dokumentet diskuterer måling av procaspase-8-behandling direkte på DISC, samt analysen av sammensetningen av dette komplekset. Dette vil bli presentert ved hjelp av CD95 DISC som det eksemplariske DR-komplekset.
Denne tilnærmingen ble først beskrevet av Kischkel et al.27 og har blitt utviklet siden da av flere grupper. Flere viktige problemstillinger må vurderes for effektiv DISC-immunoprecipitation og overvåking caspase-8 behandling i dette komplekset.
For det første er det viktig å følge alle vasketrinn under immunoprecipitation. Spesielt viktig er de siste vasketrinnene til sepharose perler og tørking av sepharose perler. Dette må gjøres riktig for å øke signal-/…
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkjenner Wilhelm Sander-Foundation (2017.008.02), Center of Dynamic Systems (CDS), finansiert av EU-programmet ERDF (European Regional Development Fund) og DFG (LA 2386) for å støtte vårt arbeid. Vi takker Karina Guttek for at han støttet eksperimentene våre. Vi anerkjenner prof. Dirk Reinhold (OvGU, Magdeburg) for å gi oss primære T-celler.
12.5% SDS gel | self made | for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED |
|
14.5 cm cell dishes | Greiner | 639160 | |
acrylamide | Carl Roth | A124.1 | |
anti-actin Ab | Sigma Aldrich | A2103 | dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3 |
anti-APO-1 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo | ALX-805-038-C100 | used only for immunoprecipitation |
anti-caspase-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
anti-caspase-3 Ab | cell signaling | 9662 S | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
anti-caspase-8 Ab C15 | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-242-C100 | dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3 |
anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
anti-c-FLIP NF6 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-961-0100 | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
anti-FADD 1C4 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ADI-AAM-212-E | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
anti-PARP Ab | cell signaling | 9542 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
APS | Carl Roth | 9592.3 | |
β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.2 | |
Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml |
Bio Rad | 500-0006 | used according to manufacturer's instructions |
CD95L | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-522-020-C005 | |
chemoluminescence detector Chem Doc XRS+ |
Bio Rad | ||
cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | prepared according to manufacturer's instructions |
DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge |
eletrophoresis buffer | self made | 10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage |
|
glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
Goat Anti-Mouse IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
Goat Anti-Mouse IgG2b | SouthernBiotech | 1090-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
Interleukin-2 Human(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | for activation of T cells |
KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL |
Bio Rad | 161-0747 | prepared according to manufacturer's instructions |
Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUFO500 | |
lysis buffer | self made | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O |
|
medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium |
medium for primary T cells | gibco by Life Technologie | 21875034 | adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium |
milk powder | Carl Roth | T145.4 | |
Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
PBST | self made | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage |
|
PBST + 5% milk | self made | 50 g milk powder + 1 L PBST | |
PHA | Thermo Fisher Scientific | R30852801 | for actavation of T ells |
Power Pac HC | Bio Rad | ||
Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | use between 3-5 µL |
Protein A Sepharose CL-4B beads | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions |
scraper | VWR | 734-2602 | |
SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
shaker | Heidolph | ||
sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer | Bio Rad | 10026938 | prepared according to manufacturer's instructions |
TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |