Målesammensetning av CD95 Dødsinduserende signalkompleks og behandling av Procaspase-8 i dette komplekset
Summary
Her presenteres en eksperimentell arbeidsflyt som muliggjør deteksjon av caspase-8-behandling direkte ved det dødsinduserende signalkomplekset (DISC) og bestemmer sammensetningen av dette komplekset. Denne metodikken har brede anvendelser, fra å avdekke molekylære mekanismer for celledødsveier til dynamisk modellering av apoptosenettverk.
Abstract
Ekstrinsisk apoptose formidles ved aktivering av dødsreseptorer (DRs) som CD95/Fas/APO-1 eller tumornekrosefaktorrelatert apoptoseinduserende ligand (TRAIL)-reseptor 1/reseptor 2 (TRAIL-R1/R2). Stimulering av disse reseptorene med deres cognate ligander fører til montering av dødsinduserende signalkompleks (DISC). DISC består av DR, adapterproteinet Fas-assosiert protein med dødsdomene (FADD), procaspases-8/-10 og cellulære FADD-lignende interleukin (IL)-1β-konverterende enzymhemmende proteiner (c-FLIPer). DISC fungerer som en plattform for procaspase-8-behandling og aktivering. Sistnevnte skjer via dimerisering/oligomerisering i dødseffektordomenet (DED) filamenter samlet på DISC.
Aktivering av procaspase-8 etterfølges av behandlingen, som skjer i flere trinn. I dette arbeidet beskrives en etablert eksperimentell arbeidsflyt som tillater måling av DISC-dannelse og behandling av procaspase-8 i dette komplekset. Arbeidsflyten er basert på immunoprecipitation teknikker støttet av vestlige blot analyse. Denne arbeidsflyten tillater nøye overvåking av ulike trinn i procaspase-8 rekruttering til DISC og dens behandling og er svært relevant for å undersøke molekylære mekanismer for ekstrinsisk apoptose.
Introduction
En av de best studerte dødsreseptorene (DRs) er CD95 (Fas, APO-1). Den ekstrinsiske apoptotiske banen starter med samspillet mellom DR og konjakkligaden, det vil si at CD95L samhandler med CD95 eller TRAIL binder seg til TRAIL-Rs. Dette resulterer i dannelsen av DISC ved tilsvarende DR. DISC består av CD95, FADD, procaspase-8/-10 og c-FLIP proteiner1,2. Videre er DISC montert ved interaksjoner mellom dødsdomene (DD)-inneholdende proteiner, for eksempel CD95 og FADD, og DED-inneholdende proteiner som FADD, procaspase-8/-10 og c-FLIP (Figur 1). Procaspase-8 gjennomgår oligomerisering via assosiasjon av sine DED-er, noe som resulterer i dannelse av DED-filamenter, etterfulgt av procaspase-8 aktivering og behandling. Dette utløser en kaspasekaskade, som fører til celledød (Figur 1)3,4. Dermed er procaspase-8 en sentral initiator caspase av den ekstrinsiske apoptosebanen mediert av CD95 eller TRAIL-Rs, aktivert på den tilsvarende makromolekylære plattformen, DISC.
To isoformer av procaspase-8, nemlig procaspase-8a (p55) og -8b (p53), er kjent for å bli rekruttert til DISC5. Begge isoformene består av to DED-er. DED1 og DED2 er plassert på N-terminaldelen av procaspase-8a/b etterfulgt av katalytiske p18- og p10-domener. Detaljert kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) analyse av procaspase-8 DEDs avslørte montering av procaspase-8 proteiner i filamentøse strukturer kalt DED filamenter4,6. Bemerkelsesverdig nok ble de lineære procaspase-8-kjedene opprinnelig foreslått å være engasjert i dimeriseringen etterfulgt av procaspase-8-aktivering ved DISC. Nå er det kjent at disse kjedene bare er en understruktur av procaspase-8 DED-filamentet, sistnevnte består av tre kjeder samlet i en trippel helix3,4,6,7.
Ved dimerisering ved DED-filamentet fører konformasjonsendringer i procaspase-8a/b til dannelsen av det aktive sentrum av procaspase-8 ogaktiveringen 3,8. Dette etterfølges av procaspase-8-behandling, som formidles via to veier: den første går via genereringen av et p43 / p41 spaltingsprodukt og den andre via den første generasjonen av et p30 spaltingsprodukt. p43/p41-banen initieres av spaltingen av procaspase-8a/b ved Asp374, noe som resulterer i p43/p41- og p12-spaltingsprodukter (Figur 2). Videre er disse fragmentene automatisk katalytisk spaltet på Asp384 og Asp210/216, noe som gir opphav til dannelsen av den aktive caspase-8 heterotetramer, p102/p1829,10,11. I tillegg ble det vist at parallelt med p43/p41-behandlingsforløpet, er procaspase-8a/b også spaltet på Asp216, noe som fører til dannelsen av C-terminal spaltingsproduktet p30, etterfulgt av proteolyse til p10 og p1810 (Figur 2).
Procaspase-8a/b-aktivering ved DED-filamentet er strengt regulert av proteiner kalt c-FLIPer12. c-FLIP-proteinene forekommer i tre isoformer: c-FLIPLong (c-FLIPL), c-FLIPShort (c-FLIPS) og c-FLIPRaji (c-FLIPR). Alle tre isoformene inneholder to DED-er i N-terminalområdet. c-FLIPL har også et C-terminal katalytisk inaktivt caspase-lignende domene12,13. Både korte isoformer av c-FLIP-c-FLIPS og c-FLIPR-virker på en anti-apoptotisk måte ved å forstyrre DED-filamentformasjonen ved DISC6,14,15. I tillegg kan c-FLIPL regulere caspase-8-aktivering på en konsentrasjonsavhengig måte. Dette kan resultere i både pro- og anti-apoptotiske effekter16,17,18. Ved å danne den katalytisk aktive procaspase-8/c-FLIP L-heterodimeren, fører c-FLIPL til stabilisering av det aktive sentrum av procaspase-8 og aktiveringen. Den pro- eller anti-apoptotiske funksjonen til c-FLIPL er direkte avhengig av mengden ved DED-filamentene og den påfølgende mengden montert procaspase-8/c-FLIPL heterodimers19. Lave eller mellomliggende konsentrasjoner av c-FLIPL ved DISC resulterer i tilstrekkelige mengder procaspase-8/c-FLIP L-heterodimere ved DED-filamentet, som støtter aktivering av caspase-8. I motsetning fører økte mengder c-FLIPL direkte til sine anti-apoptotiske effekter ved DISC20.
Samlet sett er aktivering og behandling av procaspase-8a/b på DISC en svært regulert prosess som involverer flere trinn. Dette dokumentet diskuterer måling av procaspase-8-behandling direkte på DISC, samt analysen av sammensetningen av dette komplekset. Dette vil bli presentert ved hjelp av CD95 DISC som det eksemplariske DR-komplekset.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne tilnærmingen ble først beskrevet av Kischkel et al.27 og har blitt utviklet siden da av flere grupper. Flere viktige problemstillinger må vurderes for effektiv DISC-immunoprecipitation og overvåking caspase-8 behandling i dette komplekset.
For det første er det viktig å følge alle vasketrinn under immunoprecipitation. Spesielt viktig er de siste vasketrinnene til sepharose perler og tørking av sepharose perler. Dette må gjøres riktig for å øke signal-/…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkjenner Wilhelm Sander-Foundation (2017.008.02), Center of Dynamic Systems (CDS), finansiert av EU-programmet ERDF (European Regional Development Fund) og DFG (LA 2386) for å støtte vårt arbeid. Vi takker Karina Guttek for at han støttet eksperimentene våre. Vi anerkjenner prof. Dirk Reinhold (OvGU, Magdeburg) for å gi oss primære T-celler.
Materials
| 12.5% SDS gel | self made | for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED |
|
| 14.5 cm cell dishes | Greiner | 639160 | |
| acrylamide | Carl Roth | A124.1 | |
| anti-actin Ab | Sigma Aldrich | A2103 | dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-APO-1 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo | ALX-805-038-C100 | used only for immunoprecipitation |
| anti-caspase-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-3 Ab | cell signaling | 9662 S | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-8 Ab C15 | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-242-C100 | dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-c-FLIP NF6 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-961-0100 | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-FADD 1C4 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ADI-AAM-212-E | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-PARP Ab | cell signaling | 9542 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| APS | Carl Roth | 9592.3 | |
| β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.2 | |
| Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml |
Bio Rad | 500-0006 | used according to manufacturer's instructions |
| CD95L | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-522-020-C005 | |
| chemoluminescence detector Chem Doc XRS+ |
Bio Rad | ||
| cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | prepared according to manufacturer's instructions |
| DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge |
| eletrophoresis buffer | self made | 10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage |
|
| glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Mouse IgG2b | SouthernBiotech | 1090-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Interleukin-2 Human(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | for activation of T cells |
| KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
| loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL |
Bio Rad | 161-0747 | prepared according to manufacturer's instructions |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUFO500 | |
| lysis buffer | self made | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O |
|
| medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium |
| medium for primary T cells | gibco by Life Technologie | 21875034 | adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium |
| milk powder | Carl Roth | T145.4 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| PBST | self made | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage |
|
| PBST + 5% milk | self made | 50 g milk powder + 1 L PBST | |
| PHA | Thermo Fisher Scientific | R30852801 | for actavation of T ells |
| Power Pac HC | Bio Rad | ||
| Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | use between 3-5 µL |
| Protein A Sepharose CL-4B beads | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions |
| scraper | VWR | 734-2602 | |
| SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
| shaker | Heidolph | ||
| sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer | Bio Rad | 10026938 | prepared according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
| Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |
References
- Lavrik, I. N., Krammer, P. H. Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC. Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).
- Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. Life and death in peripheral T cells. Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).
- Dickens, L. S., et al. A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death. Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).
- Fu, T. -. M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
- Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).
- Fox, J. L., et al. Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
- Schleich, K., et al. Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model. Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).
- Hughes, M. A., et al. Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival. Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).
- Lavrik, I., et al. The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2]. Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).
- Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation. Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).
- Golks, A., et al. The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation. Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).
- Oztürk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions. Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).
- Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).
- Hughes, M. A., et al. Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate. Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).
- Hillert, L. K., et al. Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly. Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).
- Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).
- Micheau, O., et al. The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).
- Chang, D. W., et al. C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis. EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).
- Hillert, L. K., et al. Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer. Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).
- Fricker, N., et al. Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL. Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).
- Arndt, B., et al. Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation. Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).
- Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network. Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).
- Schleich, K., et al. Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain. Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).
- Lavrik, I. N., et al. Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling. Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).
- Sprick, M. R., et al. Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8. EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).
- Neumann, L., et al. Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells. Molecular Systems Biology. 6 (1), 352 (2010).
- Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).
- Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways. Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).
- Kallenberger, S. M., et al. Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis. Science Signaling. 7 (316), 23 (2014).
