Mätning av sammansättning av CD95 death-inducerande signalkomplex och bearbetning av procaspase-8 i detta komplex
Summary
Här presenteras ett experimentellt arbetsflöde som möjliggör detektion av caspase-8-bearbetning direkt vid det dödsframkallande signalkomplexet (DISC) och bestämmer sammansättningen av detta komplex. Denna metodik har breda tillämpningar, från att riva upp de molekylära mekanismerna för celldödsvägar till dynamisk modellering av apoptosnätverk.
Abstract
Extrinsisk apoptos förmedlas av aktivering av dödsreceptorer (DR) såsom CD95/Fas/APO-1 eller tumörnekrosfaktorrelaterad apoptos-inducerande ligand (TRAIL)-receptor 1/receptor 2 (TRAIL-R1/R2). Stimulering av dessa receptorer med deras cognate ligands leder till monteringen av det dödsframkallande signalkomplexet (DISC). DISC består av DR, adapterproteinet Fas-associerat protein med dödsdomän (FADD), procaspases-8/-10 och cellulära FADD-liknande interleukin (IL)-1β-konvertera enzymhämmande proteiner (c-FLIPs). DISC fungerar som en plattform för procaspase-8 bearbetning och aktivering. Den senare sker via dess dimerization/oligomerization i död verkställer domänen (DED) filament monterade på DISC.
Aktivering av procaspase-8 följs av dess bearbetning, som sker i flera steg. I detta arbete beskrivs ett etablerat experimentellt arbetsflöde som möjliggör mätning av DISC-bildning och bearbetning av procaspase-8 i detta komplex. Arbetsflödet är baserat på immunoprecipitationstekniker som stöds av western blot analys. Detta arbetsflöde möjliggör noggrann övervakning av olika steg av procaspase-8 rekrytering till DISC och dess bearbetning och är mycket relevant för att undersöka molekylära mekanismer för extrinsic apoptos.
Introduction
En av de bäst studerade dödsreceptorerna (DR) är CD95 (Fas, APO-1). Den extrinsiska apoptotiska vägen börjar med interaktionen mellan DR och dess cognate ligand, dvs CD95L interagerar med CD95 eller TRAIL binder till TRAIL-Rs. Detta resulterar i bildandet av skivan vid motsvarande DR. DISC består av CD95, FADD, procaspase-8/-10 och c-FLIP proteiner1,2. Dessutom monteras skivan genom interaktioner mellan DD-innehållande proteiner (Death Domain) som CD95 och FADD, och DED-innehållande proteiner som FADD, procaspase-8/-10 och c-FLIP (figur 1). Procaspase-8 genomgår oligomerization via associering av dess DED, vilket resulterar i bildandet av DED filament, följt av procaspase-8 aktivering och bearbetning. Detta utlöser en kaskadkad, vilket leder till celldöd (figur 1)3,4. Procaspase-8 är således en central initiator caspase av extrinsic apoptos utbildningsavsnitt medierad av CD95 eller TRAIL-Rs, aktiveras på motsvarande makromolekylära plattform, DISC.
Två isoformer av procaspase-8, nämligen procaspase-8a (p55) och -8b (p53), är kända för att rekryteras till DISC5. Båda isoformerna består av två DED. DED1 och DED2 finns vid N-terminaldelen av procaspase-8a/b följt av de katalytiska p18- och p10-domänerna. Detaljerad kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) analys av procaspase-8 DEDs visade monteringen av procaspase-8 proteiner i filamentösa strukturer som kallas DED filament4,6. Anmärkningsvärt, den linjära procaspase-8 kedjor föreslogs ursprungligen att vara engagerad i dimerization följt av procaspase-8 aktivering på DISC. Det är nu känt att dessa kedjor bara är en understruktur av procaspase-8 DED-filamentet, den senare består av tre kedjor monterade i en trippel helix3,4,6,7.
Vid dimerisering vid DED-filamentet leder konformationsförändringar i procaspase-8a/b till bildandet av det aktiva mitten av procaspase-8 och dess aktivering3,8. Detta följs av procaspase-8-bearbetning, som förmedlas via två vägar: den första går via generering av en p43/ p41 klyvningsprodukt och den andra via den första generationen av en p30 klyvningsprodukt. P43/p41-vägen initieras genom klyvning av procaspase-8a/b vid Asp374, vilket resulterar i p43/p41 och p12 klyvningsprodukter(figur 2). Vidare är dessa fragment automatiskt katalytiskt klyvade vid Asp384 och Asp210/216, vilket ger upphov till bildandet av den aktiva caspase-8 heterotetramer, p102/ p1829,10,11. Dessutom visade det sig att parallellt med p43/p41-bearbetningsvägen klyvs även procaspase-8a/b vid Asp216, vilket leder till bildandet av C-terminalens klyvningsprodukt p30, följt av dess proteolys till p10 och p1810 (figur 2).
Procaspase-8a/b aktivering vid DED-filamentet regleras strikt av proteiner som heter c-FLIPs12. C-FLIP-proteinerna förekommer i tre isoformer: c-FLIPLong (c-FLIPL),c-FLIPShort (c-FLIPS) och c-FLIPRaji (c-FLIPR). Alla tre isoformerna innehåller två DEDs i deras N-terminal region. c-FLIPL har också en C-terminal katalytiskt inaktiv caspase-liknande domän12,13. Båda korta isoformerna av c-FLIP-c-FLIPS och c-FLIPR-verkar på ett antiapoptotiskt sätt genom att störa DED-filamentbildningen vid DISC6,14,15. Dessutom kan c-FLIPL reglera caspase-8 aktivering på ett koncentrationsberoende sätt. Detta kan resultera i både pro- och anti-apoptotiska effekter16,17,18. Genom att bilda den katalytiskt aktiva procaspase-8/c-FLIPL heterodimer leder c-FLIPL till stabilisering av det aktiva centrumet av procaspase-8 och dess aktivering. Den pro- eller antiapoptotiska funktionen hos c-FLIPL är direkt beroende av dess mängd vid DED-filamenten och den efterföljande mängden monterade procaspase-8/c-FLIPL heterodimers19. Låga eller mellanliggande koncentrationer av c-FLIPL vid DISC resulterar i tillräckliga mängder procaspase-8/c-FLIPL heterodimerer vid DED-filamentet, vilket stöder aktivering av caspase-8. Däremot leder ökade mängder c-FLIPL direkt till dess anti-apoptotiska effekter vid DISC20.
Sammantaget är aktivering och bearbetning av procaspase-8a/b vid DISC en starkt reglerad process som omfattar flera steg. Detta dokument diskuterar mätningen av procaspase-8 bearbetning direkt på DISC samt analysen av sammansättningen av detta komplex. Detta kommer att presenteras med CD95 DISC som det exemplariska DR-komplexet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta tillvägagångssätt beskrevs först av Kischkel et al.27 och har framgångsrikt utvecklats sedan dess av flera grupper. Flera viktiga frågor måste övervägas för effektiv DISC-immunoprecipitation och övervakning caspase-8 bearbetning i detta komplex.
För det första är det viktigt att följa alla tvättsteg under immunoprecipitation. Särskilt viktiga är de sista tvättstegen i sefarospärlorna och torkningen av sefarospärlor. Detta måste göras korrekt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi uppmärksammar Wilhelm Sander-Foundation (2017.008.02), Center of Dynamic Systems (CDS), finansierat av EU-programmet ERUF (Europeiska regionala utvecklingsfonden) och DFG (LA 2386) för att stödja vårt arbete. Vi tackar Karina Guttek för att hon stöttar våra experiment. Vi bekräftar prof. Dirk Reinhold (OvGU, Magdeburg) för att ge oss primära T-celler.
Materials
| 12.5% SDS gel | self made | for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED |
|
| 14.5 cm cell dishes | Greiner | 639160 | |
| acrylamide | Carl Roth | A124.1 | |
| anti-actin Ab | Sigma Aldrich | A2103 | dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-APO-1 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo | ALX-805-038-C100 | used only for immunoprecipitation |
| anti-caspase-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-3 Ab | cell signaling | 9662 S | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-8 Ab C15 | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-242-C100 | dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-c-FLIP NF6 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-961-0100 | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-FADD 1C4 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ADI-AAM-212-E | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-PARP Ab | cell signaling | 9542 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| APS | Carl Roth | 9592.3 | |
| β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.2 | |
| Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml |
Bio Rad | 500-0006 | used according to manufacturer's instructions |
| CD95L | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-522-020-C005 | |
| chemoluminescence detector Chem Doc XRS+ |
Bio Rad | ||
| cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | prepared according to manufacturer's instructions |
| DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge |
| eletrophoresis buffer | self made | 10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage |
|
| glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Mouse IgG2b | SouthernBiotech | 1090-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Interleukin-2 Human(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | for activation of T cells |
| KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
| loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL |
Bio Rad | 161-0747 | prepared according to manufacturer's instructions |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUFO500 | |
| lysis buffer | self made | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O |
|
| medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium |
| medium for primary T cells | gibco by Life Technologie | 21875034 | adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium |
| milk powder | Carl Roth | T145.4 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| PBST | self made | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage |
|
| PBST + 5% milk | self made | 50 g milk powder + 1 L PBST | |
| PHA | Thermo Fisher Scientific | R30852801 | for actavation of T ells |
| Power Pac HC | Bio Rad | ||
| Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | use between 3-5 µL |
| Protein A Sepharose CL-4B beads | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions |
| scraper | VWR | 734-2602 | |
| SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
| shaker | Heidolph | ||
| sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer | Bio Rad | 10026938 | prepared according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
| Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |
References
- Lavrik, I. N., Krammer, P. H. Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC. Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).
- Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. Life and death in peripheral T cells. Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).
- Dickens, L. S., et al. A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death. Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).
- Fu, T. -. M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
- Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).
- Fox, J. L., et al. Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
- Schleich, K., et al. Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model. Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).
- Hughes, M. A., et al. Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival. Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).
- Lavrik, I., et al. The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2]. Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).
- Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation. Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).
- Golks, A., et al. The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation. Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).
- Oztürk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions. Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).
- Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).
- Hughes, M. A., et al. Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate. Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).
- Hillert, L. K., et al. Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly. Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).
- Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).
- Micheau, O., et al. The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).
- Chang, D. W., et al. C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis. EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).
- Hillert, L. K., et al. Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer. Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).
- Fricker, N., et al. Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL. Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).
- Arndt, B., et al. Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation. Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).
- Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network. Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).
- Schleich, K., et al. Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain. Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).
- Lavrik, I. N., et al. Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling. Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).
- Sprick, M. R., et al. Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8. EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).
- Neumann, L., et al. Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells. Molecular Systems Biology. 6 (1), 352 (2010).
- Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).
- Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways. Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).
- Kallenberger, S. M., et al. Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis. Science Signaling. 7 (316), 23 (2014).
