Summary
Denne publikation beskriver designet af laboratoriefotobioreaktorer (PBR'er) med tilpassede lysregimer. Væksten af cyanobakterier eller mikroalger, der bruger bicarbonat som deres kulstofkilde, overvåges kontinuerligt ved at måle volumetrisk iltproduktion. Disse PBR'er letter hurtige, replikerede laboratorievækstsammenligninger med lidt brugerintervention under eksperimenter.
Abstract
Laboratorieundersøgelsen af mikroalger kan være eksperimentelt udfordrende. Ud over dyrkningskravene til ikke-fotosyntetiske mikroorganismer kræver fototrofer også belysning. Rutinemæssigt søger forskere at levere brugerdefinerede lysforsyninger, dvs. variere lysintensiteten og tiden, hvormed den leveres. En sådan fleksibilitet er vanskelig med standard bordlamper. Normalt kræver dyrkningsundersøgelser også vækstsammenligninger mellem eksperimentelle behandlinger. Ofte vurderes væksten over en længere varighed, f.eks. flere gange om dagen i løbet af en uges prøveperiode. Manuelle målinger kan være tidskrævende og mangle dataopløsning. Derfor er fotobioreaktorer (PBR'er) med automatisk vækstovervågning og tilpasselig lysforsyning nyttige til replikerede eksperimenter med flere behandlinger. Det nuværende arbejde præsenterer design, konstruktion og drift af laboratorie PBR'er. Materialerne er let fremskaffede og relativt billige. Designet kunne duplikeres med moderat dygtighed. Hver struktur har et fodaftryk på ~ 40 cm2 og er vært for tre 1 L glasflasker til tredobbelt replikation. Flasker hviler på platforme, der indeholder magnetiske omrørere og er anbragt lodret inden for et 1 m højt og 15 cm diameter polyvinylchlorid (PVC) rør. Rørinteriøret er foret med lysemitterende dioder (lysdioder). Disse lysdioder producerer kontinuerlige lysintensiteter fra 0-2400 μmol fotoner m-2 s-1 af fotosyntetisk aktiv stråling (PAR). Brugere designer et brugerdefineret belysningsprogram. Lysintensiteten kan justeres hvert sekund eller holdes konstant i længere tid. Oxygen produceret fra fotosyntese forlader hver flaske via en envejs volumetrisk gassensor. Software bruges til at registrere gassensordata. Mængden af produceret ilt kan korreleres med biomassevækst. Hvis der kræves biomasseprøver, kan en sprøjte bruges til at ekstrahere kultur. Metoden er velegnet til mikroalger dyrket med bicarbonat som kulstofkilde. Disse PBR'er er værdifulde for et laboratorium, der kræver replikerede eksperimenter, let regimefleksibilitet og kontinuerlige vækstdata i høj opløsning.
Introduction
Mikroalger og cyanobakterier, samlet kaldet mikroalger for enkelhed, er forkæmper for deres potentiale inden for bæredygtig bioteknologi. De er attraktive kandidater på grund af deres hurtige vækst, evne til at blive dyrket på ikke-agerjord og for deres brug af sollys til at drive omdannelsen af kuldioxid til biomasse 1,2,3. Mikroalgebiomasse kan omdannes til produkter som bioenergi i form af olie eller gas, fødevarefarvestoffer og kosttilskud og materialer som biopolymerer 1,4,5,6,7. Derudover kan de bruges til at behandle spildevand eller afhjælpe vandområder ved at forbruge overskydende næringsstoffer 8,9. I betragtning af dette er mikroalgeforskning udbredt og etableret. Feltet vokser, efterhånden som samfundet genovervejer kulstofintensiteten og den miljømæssige bæredygtighed af de nuværende fremstillings- og energiproduktionsmetoder.
Tre grundlæggende krav til laboratoriebaserede mikroalgeundersøgelser er en kulturbeholder, lyskilde og metode til kvantificering af vækst. Udtrykket fotobioreaktor (PBR) beskriver en opsætning, hvor kulturkar er belyst10. Almindeligvis sigter undersøgelser af mikroalger mod at sammenligne vækst mellem to eller flere behandlinger, fx forskellige vækstmedier, lysregimer eller arter 11,12,13. Af hensyn til statistisk relevans bør hver tilstand, f.eks. behandling og kontrol, replikeres. Hvis kontrol og behandling gennemføres samtidigt, betyder det, at mange PBR-stoffer skal overvåges og udtages i løbet af et forsøg. Udfordringen med at betjene flere PBR'er er todelt. For det første er det vigtigt for reproducerbarheden at levere en ensartet lysintensitet til hver PBR, men det kan være vanskeligt. Mængden af lysindfald på fartøjets overflade påvirkes af dens afstand fra lyskilden, skygge fra tilstødende fartøjer og baggrundslysudsving14. For det andet skal der vælges en metode til nøjagtig kvantificering af væksten.
Vækst måles almindeligvis ved celletal, optisk densitet (OD), klorofyl A-indhold, tørvægt (DW) densitet og askefri tørvægt (AFDW) densitet15. Celletællinger, klorofyl A-indhold og gravimetriske metoder er manuelle processer, der producerer diskrete datapunkter. OD kan måles kontinuerligt og ikke-invasivt med et spektrofotometer, forudsat at det er godt kalibreret mod en anden metode såsom AFDW-densitet15. OD-målinger og klorofyl A-indhold kan dog være upålidelige, da resultaterne varierer under forskellige dyrkningsforhold, f.eks. mellem arter og gennem hele vækstcyklussen 15,16. For klorofyl A kan ekstraktionsmetoden også påvirke pigmentudbyttet17. Klorofyl A-indhold er særligt nyttigt til sporing af væksten af mikroalger inden for mikrobielle samfund, som også indeholder ikke-fotosyntetiske organismer17,18. Når man vælger en metode til bestemmelse af vækst, er det vigtigt at overveje suspensionens morfologi. Når organismer klumper sig sammen og ikke blandes godt, er OD og celletal ikke mulige15. En enkelt metode er ikke egnet til alle eksperimentelle anvendelser - forskere skal beslutte, hvilke metoder der er praktiske og relevante for deres eksperimentelle mål.
AFDW er en pålidelig metode, der muliggør vækstsammenligninger mellem forskellige kulturforhold, især mellem arter og kulturmedier 15,19,20. For at beregne AFDW koncentreres en prøve af mikroalgekultur først, enten ved filtrering eller centrifugering, og tørres. På dette stadium kan DW bestemmes. Normalt indeholder DW-prøven mindst 8-10% aske-uorganisk materiale såsom salte og partikler15. DW sporer væksttendenser, men kan skæves, hvis uorganiske stoffers bidrag varierer. For at bestemme AFDW-densitet forbrændes tør biomasse ved høj temperatur; dette fordamper den organiske eller nyttige del, mens aske (uorganiske stoffer) efterlades19. For at beregne AFDW trækkes vægten af askefraktionen fra vægten af DW-fraktionen. I mikroalge suspensioner varierer AFDW typisk fra 0,1-3 g / L 12,21,22. Små mængder fortyndede suspensioner giver lidt tør biomasse, <10 mg. Efter forbrænding må aske kun veje 1 mg. Afhængigt af kulturtætheden kræver denne metode derfor volumener mellem 5-100 ml og analytiske skalaer nøjagtige til 0,1 mg 12,15,19,22. Laboratorie PBR'er er typisk små, højst et par liter, hvorfor hver flydende prøve udtømmer kulturvolumen. Endvidere er AFDW-metoden manuel og tager 2-3 dage. For replikerede og gentagne eksperimenter foretrækkes en automatiseret og kontinuerlig proces.
For mikroalger, der bruger bicarbonat som kulstofkilde, kan to yderligere vækstmålinger måles kontinuerligt. Fotosyntese forbruger bicarbonat og producerer ilt. Forbruget af bikarbonat øger middelpH-værdien 23. En nedsænket pH-sonde kan måle denne ændring. Fotosyntetisk iltproduktion øger mediets koncentration af opløst ilt (DO), indtil mediet er mættet. Ud over mætning eksisterer ilt som bobler. Iltproduktion måles ved hjælp af mange forskellige teknikker: sonder måler DO-koncentration, manometriske enheder vurderer headspace-tryk, gaskromatografi måler headspace-sammensætning, og volumetriske sensorer registrerer gasudstrømning 24,25,26,27. Når ilt anvendes som vækstproxy, skal kulturbeholdere være fuldt forseglede eller kun tillade gasudstrømning. Til pH- og iltmålinger skal kulstof tilføres i form af bicarbonat, ikke ved CO2 -sparging. CO2 -sparging reducerer medium pH23 og kan som gas forstyrre iltmålinger. En fordel ved pH og ilt i forhold til optisk densitet er, at metoden ikke kompromitteres, hvis mikroalger danner klumper. Selvom det er indirekte, er både pH og ilt effektive til at sammenligne vækst mellem behandlinger.
PBR'er, der er i brug i dag, varierer i kompleksitet. Laboratorier kan bruge enkle bordkolber, brugerdefinerede prototyper eller kommercielt tilgængelige produkter. For forskergrupper, der søger at opgradere fra kolber, kan omkostningerne ved kommercielle PBR'er eller teknisk færdighed og delfremstilling, der kræves for at bygge mange prototyper, være en barriere. Dette manuskript har til formål at beskrive det trinvise design, konstruktion og drift af laboratorie-PBR'er, der bygger bro over dette hul. Disse PBR'er har et tilpasseligt lysregime og overvåger væksten kontinuerligt ved at registrere volumetrisk iltproduktion. Dette design huser tre kulturfartøjer til tredobbelt replikation og kan bygges med moderat dygtighed og let tilgængelige materialer. Denne PBR er en værdifuld tilføjelse til et laboratorium, der ønsker at udvide sin kapacitet til mikroalgeforskning uden at investere i meget tekniske eller dyre produkter. Når forskere vælger at erhverve eller bygge en PBR, skal de overveje et designs egnethed til deres kulturforhold, økonomiske stilling og forskningsspørgsmål.
Protocol
1. Opførelse af PBR-tribunen
- Skær fem 380 mm længder og to 200 mm længder af vinklet slidset stål med en håndholdt båndsav. Fastgør sammen med bolte og store hjørnebøjler for at lave et stativs base (figur 1A). Lim på sikkerhedshætter.
- Tilslut to uskårne (1220 mm) lodrette længder af vinklet slidset stål til bunden. Fastgør med bolte og metalhjørnekisler (figur 1B). Lim på sikkerhedshætter.
- Skær fire 65 mm flade længder af slidset stål. Bolt disse i 90° vinkler på de lodrette understøtninger - fastgør to til hver understøtning, en 130 mm op fra bunden (figur 1C) og en 60 mm ned fra toppen.
- Fastgør lodrette understøtninger på tværs af deres top med en vandret 140 mm længde af fladt slidset stål (tværbjælke) boltet på bagsiden af rammen (figur 2A).
2. Konstruktion af lyskammeret
- Skær et hvidt polyvinylchloridrør (PVC) med en diameter på 153 mm til en længde på 1070 mm. Skær røret halvt i længderetningen med en båndsav. Slib alle kanter.
- Jævnt plads og midt fire aluminium kølelegeme kanaler lodret sammen med det indre af røret. Fastgør ikke kanaler inden for 20 mm fra rørets afskårne kant. Fastgør kanalerne på plads øverst og nederst med små bolte (figur 2B).
- Bolt halvdelen af røret til stativet ved hjælp af de vandrette understøtninger, der er udformet i trin 1.3.
- Læg reaktoren ned og genforene rørhalvdelene ved at tape dem sammen. Centrer klaverhængslet langs en cutline. Spor hængselhullerne, og bor røret i overensstemmelse hermed. Brug en nittepistol og mellemlange nitter til at fastgøre hængslet til røret.
- Brug en lille bungee-ledning (se Materialetabel) til at holde røret lukket (figur 1C).
- Kontakt en elektriker for at tilslutte LED-lysene og installere følgende fire komponenter: LED-driver, digital multiplex (DMX) dekoder, DMX-lysstyring og switchboks (se materialetabel). Alle komponenterne anbringes bag på PBR i henhold til figur 2A.
3. Konstruktion af flaskeplatformene
- Skær platformformer (figur 3A) ud af hård plast, f.eks. højdensitetspolyethylen (HDPE) (se materialetabel), ved hjælp af cnc-fræsning (computer numerical control). Lav tre af hver form.
BEMÆRK: Det anbefales at skære ekstra top- og bundlag. - Tape bund- og toplaget sammen. Marker og bor fem små huller, 6 mm i diameter, gennem begge former (figur 3A). Brug en større borekrone til forsigtigt at udvide overfladen af disse huller, så bolthoveder kan forsænkes (figur 3B).
- For hver af de tre platforme boltes to små hjørnebøjler på den bageste halvdel af røret.
BEMÆRK: Afstanden mellem toppen af selerne skal være 350 mm. - Centrer hvert bundlag oven på dets seler. Marker placeringen af borehullerne under selerne. Bor to huller med en diameter på 6 mm. Brug en større borekrone til forsigtigt at udvide overfladen af hullerne, så boltene kan forsænkes.
- Bolt nederste lag til deres seler (figur 3B-C).
- Skær femten stykker af 12 mm lange 6,35 mm udvendige diameter (OD) stive slanger. Sandwich fem stykker af det stive rør mellem hvert top- og bundlag. Fastgør lag og slanger sammen med lange smalle bolte i henhold til figur 3B-D.
- Bor et stort hul i PVC-røret bag hver platform. Indsæt hver mikromagnetisk omrører i sin platform. Træk hver omrørers elektriske kabel gennem disse nyskårne huller (figur 3C-E). Tilslut hver omrører til dens respektive styreenhed samt en stikkontakt.
- Placer en 1 L flaske på hver platform. Tilføj øjenbolte i bagrøret på flaskehalsniveau. Vikl en lille bungee-ledning rundt om hver flaskehals for at tilføje stabilitet (figur 4A).
BEMÆRK: I hele protokollen vil farvekodningsplatforme, flasker, magnetiske omrørere og alle tilknyttede kabler og sensorer være nyttige.
4. Konstruktion af væskeprøvetagningsporte (valgfrit)
- Skær tre 60 mm længder af 6,35 mm OD stiv slange. Brug en 5 mm borekrone til at bore huller gennem hver gummiprop. Skub stive rørlængder gennem proppen.
- Skær tre 60 mm længder af 3,18 mm OD stiv slange. Tilslut disse med en lige reducering til det fremspringende rør på undersiden af hver prop.
- Indsæt en envejs stophaneventil (f.eks. port 1 = hunluer, port 2 = hanslip Luer) i det fremspringende rør på hver propoverflade (figur 4A).
- Skær tre 30 mm længder af 3,18 mm OD fleksibel slange. Indsæt Luer fittings (f.eks. han Luer til slangemodhage og kvindelig Luer til slangemodhage) i hver ende.
- De stykker, der er fremstillet i trin 4.4, forbindes med stophaneventilerne på overfladen af hver gummiprop (figur 4A).
BEMÆRK: Mange kombinationer af stophaner og Luer fittings kan give det samme resultat. Designet skal gøre det muligt at trække væske ud eller indsættes via en sprøjte.
5. Tilslutning af volumetriske gassensorer
- Forbered gassensorer i henhold til producentens anvisninger.
BEMÆRK: Dette involverer hovedsageligt påfyldning af gassensorer med emballagevæske (figur 4B). - For at fremstille gasledningerne skal du skære tre 1000 mm længder på 3,18 mm OD fleksibel slange.
- Bor tre huller med en diameter på 4 mm i det bageste PVC-rør. Placer huller ved siden af hængslet i flaskehalsens højde. Trådgasledninger gennem disse huller (figur 4A).
- Til enden af gasledningen inde i PVC-røret skal du tilføje en Luer-montering (f.eks. Slangemodhage til han Luer) og tilslutte en envejs stophaneventil (f.eks. Port 1 = hun Luer, port 2 = han Luer).
BEMÆRK: Ventilen er kun påkrævet, når der også er installeret væskeprøveporte. - Tilslut den anden ende af gasledningen til gassensorens indløbsport ved hjælp af en lige reduktion. Fastgør denne forbindelse med et lynlås.
- Tilslut alle gassensorer til det digitale indgangsmodul (DIM) med jackstikkabler og DIM til en nærliggende computer.
- Installer dataindsamlingssoftwaren (se Materialetabel) på et Windows-operativsystem, og tilslut licensnøgledonglen. Føj sensorkalibreringsfiler til softwarens kalibreringsmappe.
6. Programmering af lysregimet
- Brug den bageste tænd / sluk-knap til at tænde PBR og tilslutte DMX-lysstyringen til en computer via et mikro-USB-kabel.
- Download SUT (Store Upgrade Tools) og LED-styringssoftwaren (se Materialetabel). Registrer DMX-lysstyringen online.
- Åbn LED-styringssoftwaren, og vælg Klik her for at arbejde med USB-DMX-grænsefladen: SUSHI-RB-RJ.
- Under fanen Opsætning i feltet ScanLibrary skal du vælge mappen Generic og Single Channel. Skift ScanLibrary-indstillinger til DMX-univers 1, antallet af armaturer til 4 og indeksnummeret til 1. I øverste højre hjørne skal du ændre rullemenuen til Listevisning. Til sidst skal du klikke på Patch (supplerende figur 1).
BEMÆRK: I DMX-universet tester en boks hver LED-strimmels kontrol ved at skubbe lysdæmperknapperne eller indtaste en numerisk værdi i tekstboksen. - Lav en standardkurve, der relaterer den digitale lysindstilling i lysstyringssoftwaren til den lysintensitet, der opleves i midten af PVC-røret (figur 5). Mål intern lysintensitet med en lille sfærisk sonde (se Materialetabel) ophængt i midten af PVC-røret.
- Gå videre til fanen Editor . Hvis du vil oprette et brugerdefineret lysprogram, skal du oprette en ny scene og begynde at tilføje trin. Se supplerende tabel 1 for et eksempel på 16:8 h dagligt program. Sæt scenen til at løkke.
BEMÆRK: Trin opdeler scener i tidsblokke, som hver især kan indstilles til forskellig lysintensitet. Trin spænder fra 1 s til 43 min. Her er 30 minutters trin mest bekvemme. Flere scener kan indlæses på en DMX-belysningscontrollerenhed. - Opret en ekstra hjælperscene, der er umiddelbart genkendelig, f.eks. to af de fire lysdioder på.
BEMÆRK: Scener kan bladres igennem manuelt ved hjælp af knappen på siden af DMX-lysstyringen. Hvis det ønskede lysprogram begynder om natten, vil det være umuligt at skelne mellem, om lysprogrammet allerede er startet. Hjælperscenen fungerer som en indikator for, at DMX-lysstyringen fungerer korrekt. - Gem scenerne, og gå videre til fanen Stand Alone . Skriv hukommelsen til DMX-lysstyringen, og frakobl enheden fra computeren.
- Tilslut DMX-lysstyringen til strømkilden ved hjælp af en mikro-USB.
- Før du starter et eksperiment, skal du teste lysprogrammet ved at logge den interne lysintensitet i en varighed på 24 timer. Hvis væsketemperaturen er af interesse, skal du logge dette samtidigt med en nedsænket temperatursonde (figur 6).
7. Start af et eksperiment
- Steriliser medier, flasker, rørestænger, gummipropper, prøveudtagningsporte, gevindskårne skruelåg og slanger.
BEMÆRK: Alle komponenter, der anvendes i dette design, kan autoklaveres undtagen ventiler og Luer-fittings - der er autoklaverbare alternativer fra andre producenter. - Åbn dataindsamlingssoftwaren, og udfyld konfigurationssiden (supplerende figur 2). Tildel kalibreringsfiler til deres respektive sensorer.
- Under Mappefilnavn skal du vælge den tilsvarende DIM-portnummermappe. Klik på Aktuel mappe og gentag for alle porte.
- Klik på OK for at gå videre til logningssiden.
- Flaskerne fyldes til det ønskede volumen med dyrkningsmedium (tillægstabel 2,3).
BEMÆRK: Hver af disse flasker kan maksimalt rumme ~ 1,1 L med et lille frirum (~ 80 ml, inklusive gasledningen). - Stamkulturen centrifugeres i tre afbalancerede 50 ml rør i 15 minutter ved 4500 x g for at give tre pellets. Tilsæt en pille til hver flaske - vask i pellets med en serologisk pipette og frisk medium.
BEMÆRK: Kulturtætheden på dag 0 er også kendt som den oprindelige biomassekoncentration (IBC). At måle IBC i gAFDW. L-1, kan yderligere 50 ml rør centrifugeres i trin 7.6. Den resulterende pellet kan derefter tørres og forbrændes 15,19. Trin 7.6 vil sandsynligvis kræve ændringer baseret på brugernes individuelle mål og deres eksperimenter. - Slip en magnetisk omrører, 25 x 8 mm, i hver flaske.
- Forsegl hver flaskeåbning med en gummiprop og gevindskåret skruelåg (figur 4A). Hvis der er installeret valgfri prøveudtagningsporte, skal du lukke ventilerne.
- Forenden af hver gasledning placeres inde i PVC-røret (indbygget i trin 5.4), og fastgør en nål til ventilens hanport.
- Tilslut hver flaske til dens gassensor ved at gennembore hver gummiprop med den tilsvarende nål.
- Start hver gassensor individuelt ved at markere afkrydsningsfeltet i venstre side af skærmen, klikke på Start og indtaste et filnavn. Klik på OK , og gentag for alle sensorer (supplerende figur 3).
BEMÆRK: Under logføring skal du ikke afslutte dataindsamlingsvinduet. Indstil computerens strøm- og dvaleindstillinger til aldrig og udsæt computeropdateringer i løbet af eksperimentet. - Tænd for PBR, og sørg for, at DMX-lysstyringen er tilsluttet en strømforsyning. Den første programmerede scene begynder automatisk. Se trin 6.7 for at bekræfte, at DMX-lysstyringen fungerer korrekt.
8. Flaskeprøvetagning (valgfrit)
- Der forberedes yderligere 500 ml af det friske substrat, inden forsøget påbegyndes (supplerende tabel 2).
BEMÆRK: Hvis et 24 timers lysprogram med en 16:8 timers daglig cyklus blev startet kl. 9, ville prøveudtagningstider før skumring og daggry falde kl. 8 og 16 (supplerende tabel 1). Her henviser daggry og skumring til 30 minutters trin, der skifter lys fra ON til OFF og omvendt. - Luk ventilen på gasledningen.
- Tilslut en sprøjte (10 ml) til prøveudtagningsportventilen (figur 4A).
- Åbn prøveudtagningsportventilen, og træk 8 ml kultur ud.
BEMÆRK: Mellem 5-10 ml anbefales. Fjernelse af væske genererer et vakuum i headspace, hvilket gør volumener >10 ml vanskelige at udtrække. - Luk prøveudtagningsportventilen, og frakobl sprøjten.
- Tilslut en sprøjte indeholdende 8 ml frisk medium (fra trin 8.1) til prøveudtagningsportventilen.
- Åbn prøveudtagningsportventilen, og injicer frisk medium.
BEMÆRK: Udskiftning af volumenet af prøvekultur med frisk medium tjener til at opretholde et lige stort headspace-volumen og tryk og skylle prøveudtagningsportlinjen. - Luk prøveudtagningsportventilen, inden sprøjten frakobles.
- Trin 8.2-8.8 gentages ved hvert prøvetagningstidspunkt.
9. Afslutning af et eksperiment
- Kontroller alle aktive portafkrydsningsfelter i dataindsamlingsvinduet, og klik på Stop.
- Hvis du vil eksportere data, skal du vælge Filer og offlinedata. Vælg alle relevante logfiler. Eksporter dataene til regnearkssoftware og gem.
- For hver flaske konverteres det samlede iltvolumen målt i ml til mol ved hjælp af den ideelle gaslov. Forudsig vægten af dyrket biomasse (gAFDW), hvis der genereres 1,05 molO2 for hver produceret mol biomasse. Tag molvægten af biomasse som 24,6 g mol-1.
- Organiser flowhastighedsdataene manuelt. Brug enheder af ml / h og et 3-punkts glidende gennemsnit.
Representative Results
Her er iltstrømningshastigheden et mål for kulturens fotosyntetiske hastighed. Højere fotosyntesehastigheder og dermed kulstoffiksering betyder højere vækstrater. Det betyder, at brugeren kan sammenligne iltstrømningshastigheder mellem forskellige behandlinger og driftsdage som en proxy for vækst. Kort fortalt fungerer gassensoren ved at fange og frigive gasbobler i en dobbeltkammermålecelle (figur 4B). Gasbobler fra indløbet i bunden af sensoren bevæger sig op gennem pakningsvæsken. Bobler akkumuleres i et kammer i målecellen til et volumen på ~ 3,2 ml. Når denne tærskel er nået, spidser målecellespidserne. Dette frigiver gassen og nulstiller systemet. Hvert tip registreres af dataindsamlingssoftwaren.
I eksempeldataene blev vækstraten for tre behandlinger med varierende dagslysintensiteter og indledende biomassekoncentrationer (IBC'er) sammenlignet. Disse behandlinger blev valgt vilkårligt til demonstrative formål. De var (A) 300 μmolfotoner m-2 s-1 og 0,03 gAFDW L-1, (B) 600 μmolfotoner m-2 s-1 og 0,13 gAFDW L-1 og (C) 600 μmolfotoner m-2 s-1 og 0,40 gAFDW L-1. Disse bestrålinger blev målt med en sfærisk sonde i midten af PVC-røret, før flasker blev anbragt på platformene. Kulturdybde og densitet påvirker lysdæmpning. Derfor kan den faktiske lysintensitet, der opleves af mikroalger, variere fra de rapporterede. Hver behandling blev udført i tre eksemplarer - inden for en PBR indeholdende tre flasker.
Her var et vellykket eksperiment præget af tæt replikerede daglige mønstre for gasproduktion (figur 7A-C). I oplyste timer (dag) steg gasproduktionen støt, og over ikke-oplyste timer (nat) stoppede gasproduktionen (figur 7A-C). To gasser produceres af mikroalger, ilt fra fotosyntese og kuldioxid fra respiration28. Fotosyntese er begrænset til oplyste timer, mens respiration sker kontinuerligt, men er mest aktiv om natten28. Fotosyntese bygger, mens respiration kataboliserer biomasse28. Indledningsvis er sammensætningen af headspace-gas identisk med atmosfærens. Med hver flip af målecellen fortrængerO2 atmosfærisk gas. Derfor blev gassensoraflæsninger tilskrevet produktionen afO2, selvom den udgående gas ikke var renO2. Det mindste gasindtagstryk for gassensoren er ekstremt lavt, 8-9 mbar, hvilket gør flaskens headspace-tryk kun lidt over atmosfærisk (1,01 bar ved havoverfladen). Derfor begynder gassensoraflæsninger kort efter, atO2-bobler forlader mediet.
CO2 frigivet fra respiration bidrager ikke til gassensoraflæsninger af to grunde. For det første reagerer CO2 i det alkaliske medium på bicarbonat, hvilket reducerer pH (figur 8). For det andet, hvis CO2 slipper ud, opløser gassensorens emballagevæske, Silox, CO2 -bobler, før de kan nå målecellen og afgasser CO2 ved væskeoverfladen29. Dette understøttes af manglen på gassensoraflæsninger natten over. De, der fandt sted, blev registreret kort efter, at lysene blev slukket, hvilket indikerer, at aflæsninger repræsenterede resterende iltfrigivelse i dagtimerne (figur 7).
I den eksperimentelle opsætning (ved hjælp af lokale temperatur- og trykdata) krævede et 80 ml hovedrum ved omgivende tryk 340 ml opløstO2 for at etablere etO2-partialtryk på 99%. Her varierede den samlede mængde ilt produceret over 4 dage fra 316 (SEM ± 11) ml i behandling A til 902 (SEM ± 51) ml i behandling C (tabel 1). Derfor ville headspace af alle flasker ved afslutningen af eksperimentet primært have indeholdt O2. Den øgede koncentration af headspaceO2 og dermed nedsat koncentration afN2 ville have påvirket disse gassers partialtryk og mætning. Med et 99% O2 headspace blev der beregnet en 5x stigning i DO. For 1,1 L-kulturerne blev dette oversat til yderligere 23 ml DO. Omvendt blev det anslået, at skiftet til et 1% N 2-frirum ville have fået 15 ml N2 til at opløses. Dette betyder, at under et næsten rent ilthovedrum blev mereO2 opløst end N2 fortrængt. Fordi mereO2 forbliver i mediet, ville denne effekt således have ført til små undervurderinger i mængden af produceret fotosyntetisk ilt.
Den største udfordring ved denne metode opstod, da kulturer blev tætte. Med mere biomasse og dermed mere respiration steg efterspørgslen efterO2 . Nat O2-forbrug genererede et headspace-undertryk. Dette fik gassensorens emballagevæske til at bevæge sig op gennem gasledningen. Da O2-produktionen blev genoptaget, skulle pakkevæsken køres tilbage i gassensorerne. Dette forårsagede en forsinkelse i den første gassensoraflæsning. Den fjerde nat fik størrelsen af dette undertryk imidlertid pakkevæske til at nå og dryppe ind i to af de tre replikater af behandling B, hvilket genererede en overfladeolieglat. På grund af det reducerede pakningsvæskeniveau kortsluttede gassensorerne og frigav umålt O2 direkte til atmosfæren. Dette fik dataindsamlingen til at flade ud (figur 7B).
Undertryk kan også være forårsaget af en temperaturinduceret sammentrækning af headspace-volumen. Effekten her var dog minimal. Kølelegemekanaler og luftstrøm spredte overskydende varme tilstrækkeligt. Af de to afprøvede lysregimer reducerede den maksimale temperaturændring headspace-volumenet med 1% eller mindre, svarende til en 800 μL pakningsvæskeforskydning i et 80 ml headspace. Det maksimale daglige temperatursving var 1,4 °C for 300 μmolfotoner m-2 s-1 regimer (figur 6) og 3,2 °C for 600 μmolfotoner m-2 s-1 regimer. Den gennemsnitlige temperaturstigning i dagtimerne for 300 og 600 μmolfotoner m-2 s-1 regimer var henholdsvis 0,7 og 1,8 °C. Kulturtemperaturerne vendte tilbage til baseline natten over (figur 6).
Vækstdata med høj opløsning kan afsløre tendenser, der ellers kan gå ubemærket hen. Overvej behandlingerne B og C. På trods af deres forskellige IBC'er genererede begge den samme mængde total biomasse (gAFDW), hvilket forårsagede et identisk skift i medium pH (tabel 1). Kun givet start- og slutdatapunkter kan en person med rette antage, at der ikke er nogen forskel i den gennemsnitlige vækstrate mellem de to behandlinger (tabel 1). Imidlertid afslørede online iltstrømningshastighedsdata, at hver behandling havde varierende daglige vækstrater. Disse variationer blev også afspejlet i pH-målinger to gange dagligt (figur 8). På første dag var behandling B's vækstrate lavere end behandling C.'s. På dag tre vendte dette med behandling B's vækstrate, der oversteg væksten for behandling C (figur 7B, C). Data om iltstrømningshastighed viste, at den højeste vækstrate forekom på dag tre i behandling B (figur 7B).
Den samlede mængde ilt, der genereres af hver flaske i de tre behandlinger, blev brugt til at estimere deres respektive ændring i den samlede biomasse (gAFDW). Dette blev opnået ved anvendelse af en generisk ligning for fotosyntetisk biomassesyntese:CO2 + 0,2 NH3 + 0,6H2O = CH1,8 O0,5 N0,2 + 1,05 O2. Stigningen i headspaceO2 partialtryk og efterfølgende stigning i DO-mætning forventedes at forårsage en lille undervurdering af biomassevæksten. Dette var tilfældet for fem ud af syv eksempler (tabel 2). I gennemsnit lå den estimerede biomassevækst inden for 10 % af den målte biomassevækst. Nogle estimater adskilte sig kun med 1-3 mg fra den målte vækst. To eksempler overvurderede væksten, dvs. der blev produceret mere ilt, end biomassevæksten kunne redegøre for. Enhver O2 , der forbruges ved respiration natten over, skal afspejles i forsinkelsen iO2-produktionen den følgende dag. Her blev eksperimenter afsluttet ved nattens afslutning. På denne måde bliver biomassekatabolisme natten over i løbet af de sidste 8 timer af hvert eksperiment ikke målt. Dette kan forårsage overvurdering af biomassevækst, især i tætte kulturer. Som sådan anbefales det, at eksperimenter afsluttes i slutningen af oplyste timer.
Figur 1: Reaktorstativbase. (A) Dimensioner af basiskomponenter i mm. (B) Orientering af metalhjørnekisler, der fastgør de to lodrette understøtninger. (C) En af fire korte stållængder forbinder den bageste halvdel af PVC-røret med reaktorstativet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Elektriske komponenter. (A) Bakspejl af PBR, der viser øverste tværbjælke og konfiguration af elektriske komponenter. (B) Frontbillede af PBR efter lysinstallation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Flaskeplatformsdetaljer. (A) Dimensioner på top- og bundlag i mm. (B) Fordybningsbolthoveder i begge lag. (C) Seler forbinder bundlaget direkte med den bageste halvdel af PVC-røret. (D) Fem korte stykker stive slanger monteret over smalle bolte holder det øverste og nederste lag fra hinanden. (E) Når flaskeplatformen er færdig, skal overfladen være plan. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Gasledning og valgfri prøveudtagningsport. (A) Gasledninger forbinder hvert flaskehovedrum med udvendige gassensorer. Hvis prøveudtagningsporten er påkrævet, skal gasledningerne have en envejsventil umiddelbart nedstrøms for nålen. (B) Volumetrisk gassensor. Væskepakningsniveauet skal røre ved sporingsskruen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Standardkurve relaterer LED-styringssoftwareindstillinger til intern lysintensitet. Hvide cirkler og grå trekanter repræsenterer hver en individuel PBR. For hver lysindstilling blev alle fire armaturer indstillet til en identisk værdi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Kulturtemperaturændring for 300 μmolfotoner m-2 s-1 lysregimer. I løbet af 24 timer, 16: 8-timers daglige program øgede lysdioder kulturtemperaturen i dagtimerne. Den blå pil angiver forskellen mellem minimums- og maksimumstemperaturen. En let programfejl forårsagede temperaturdykket før skumringen; dette blev rettet, før eksperimentet begyndte. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Iltproduktion til tre unikke forsøgsbetingelser. Hver reaktor modtog en anden kombination af lysintensitet og indledende biomassekoncentration (IBC); (A) 300 μmolfotoner m-2 s-1 og IBC 0,03 gAFDW L-1, (B) 600 μmolfotoner m-2 s-1 og IBC 0,13 gAFDW L-1, (C) 600 μmolfotoner m-2 s-1 og IBC 0,40 gAFDW L-1. Topgrafer viser kumulativ iltproduktion (ml) og gasstrømningshastigheden (ml / h). Solide sorte linjer, stiplede blå linjer og stiplede røde linjer er replikater. Køretiden for hvert eksperiment var 104 timer, hvilket omfattede fire komplette 16:8 timers dag-nat-cyklusser. Mørk orange skygge repræsenterer nattetimer og lysorange dagtimer. Bemærk, at i behandling B er iltproduktionen fladlinje på dag 4 for to af de tre replikater. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: pH-respons. Hver reaktor modtog en anden kombination af lysintensitet og IBC; (grønne diamanter) 300 μmolfotoner m-2 s-1 og IBC 0,03 gAFDW L-1, (røde trekanter) 600 μmolfotoner m2 s-1 og IBC 0,13 gAFDW L-1, (lilla cirkler) 600 μmolfotoner m-2 s-1 og IBC 0,40 gAFDW L-1 . Mørk orange skygge repræsenterer nattetimer og lysorange dagtimer. Fejllinjer repræsenterer standardfejlen i middelværdien. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Behandling | Lysintensitet (μmol fotoner m-2 s-1) | IBC (gAFDW L-1) | Δ samlet biomasse (gAFDW) | Δ pH | Samlet produceret ilt (ml) |
| En | 300 | 0.031 | 0,289 (± 0,01) | 0,15 (± 0,01) | 316,2 (±11,4) |
| B | 600 | 0.130 | 0,674 (± 0,02) | 0,52 (± 0,27) | 834.6* |
| C | 600 | 0.400 | 0,675 (± 0,02) | 0,55 (± 0,03) | 902,2 (±50,5) |
| * Kun en af de tre replikater var vellykket | |||||
Tabel 1: Vækstmetrisk skift fra time 0 til 104. Parenteser repræsenterer standardfejlen i middelværdien.
| Behandling | Lysintensitet (μmolfotoner m-2 s-1) | IBC (gAFDW L-1) | Målt biomassevækst (gAFDW) | Forventet vækst i biomasse (gAFDW) | Undervurdere (%) |
| En | 300 | 0.031 | 0.289 | 0.288 | 0.5 |
| En | 300 | 0.031 | 0.311 | 0.270 | 13.1 |
| En | 300 | 0.031 | 0.268 | 0.247 | 7.9 |
| B | 600 | 0.13 | 0.708 | 0.705 | 0.4 |
| C | 600 | 0.4 | 0.718 | 0.796 | -10.9 |
| C | 600 | 0.4 | 0.640 | 0.830 | -29.7 |
| C | 600 | 0.4 | 0.668 | 0.659 | 1.3 |
Tabel 2: Vækstskøn baseret på total målt ilt. Kun en replikat fra 300 μmolfotonerne m-2 s-1 og IBC = 0,13 gAFDW L-1 behandling løb til afslutning.
Supplerende figur 1: Skærmbillede fra LED-styringssoftware. Hver af de fire lysarmaturer kan styres uafhængigt ved at skubbe lysdæmperknapperne eller indtaste en numerisk værdi i tekstfeltet. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Skærmbillede af konfigurationsvinduet for dataindsamlingssoftware. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3: Skærmbillede af vinduet til logføring af dataindsamlingssoftware. Lysegrønne rektangler angiver online gassensorer. Data vises i realtid. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 1: Eksempel 24 timers lysregime. For et 16:8 timers dagligt program er der 48 sæt på 30 minutter hver. Stjerner angiver foreslåede prøveudtagningstider. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende tabel 2: Høj alkalinitet høj pH medium sammensætning. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende tabel 3: Opløsning af sporelementer. Der tilsættes til en slutkoncentration på 1 ml/l til basismediet. Klik her for at downloade denne tabel.
Discussion
Inden for denne protokol øger fokus på følgende trin sandsynligheden for at generere reproducerbare data af høj kvalitet. Ved konstruktion af reaktorstativet (trin 1) skal basen være robust med veljusterede lodrette understøtninger. Slidset stål har skarpe kanter, så tilføjelsen af sikkerhedshætter er afgørende. Flaskeplatformens overflader skal være helt flade, magnetomrøreren og bolthovederne skal begge sidde under det øverste lags overflade (trin 3.2-3.6). I henhold til producentens anvisninger skal gassensorens emballagevæske fyldes til "sporingsskruen for væskeniveau" for nøjagtige iltmålinger. Dette væskeniveau bør kontrolleres regelmæssigt, da fordampning af emballagevæsken kan kortslutte målecellen. Alle tre gasledninger lavet i trin 5.2 skal have samme længde; dette sikrer, at replikater har identiske headspace-volumener. Før et forsøg påbegyndes, anbefales det at teste det programmerede lysregime ved at registrere lysintensiteten over en periode på 24 timer (trin 6.11). Hvis stigninger i væsketemperaturen giver anledning til bekymring, skal denne test også omfatte en forseglet flaske med en indvendig temperatursonde (trin 6.11). Når du logger, skal du ikke afslutte softwarevinduet til dataindsamling; dette vil afslutte logning. Hvis der udtages kulturprøver, skal du passe på ikke at frigive headspace-gas ved at åbne ventiler i den forkerte rækkefølge (trin 8.2-8.8). Når du gennemgår eksperimentelle data, skal du være opmærksom på, at dataindsamlingssoftwaren automatisk genererer et glidende gennemsnit af strømningshastigheden. Dette oppuster værdien af en eller to strømningshastighedsaflæsninger, der genereres natten over. Organiser gassensorlogfiler manuelt for at rette op på dette.
Det mest almindelige tilbageslag med denne metode er potentialet til at kortslutte gassensoren, hvis væskepakningsniveauet falder. Der er to måder, dette kan ske på. For det første kan fordampning langsomt reducere væskeniveauet. Dette er dog usandsynligt over et kortvarigt (<7 dage) eksperiment29. For det andet kan høje respirationshastigheder trække ilt ind i opløsningen og generere et headspace-undertryk. Når lysenergi ikke er tilgængelig, bruger mikroalger aerob respiration til at levere den energi, der kræves til cellulær vedligeholdelse og reparation28. Derfor kan iltforbruget og det resulterende undertryk i tætte kulturer i ikke-belyste timer være betydeligt. Dette suger emballagevæske fra gassensorerne ind i gasledningen. Den afstand, som pakkevæsken bevæger sig, er proportional med mængden af respiration om natten. Hvis pakningsvæsken kommer ind i flaskerne, genererer dette en olieglat på væskeoverfladen.
Hvis der forventes høje respirationshastigheder om natten, kan der foretages ændringer i protokollen. Den enkleste måde at undgå undertryk på er at lade flaskehovedrummet være åbent natten over. Dette har også den fordel, at det letter DO-niveauerne ved at reducere det delvise headspace-tryk påO2. Høje DO-koncentrationer menes at være skadelige for væksten, daO2 kan hæmme aktiviteten af Rubisco og kan udløse oxidativ stress30,31. Det er ikke ualmindeligt, at dyrkningssuspensioner når 4x overmætning, selv når de er i kontakt med atmosfæren25,32. For at åbne headspace skal du frakoble gasledningen fra nålen, der spænder over gummiproppen. Nattetimer kan tjene som et vindue til at fylde gassensorens pakningsvæske eller manipulere kontinuerlige eksperimenter med ringe indflydelse på dataindsamlingen. For eksempel kan man ændre kulturtætheden, opdatere næringsstoffer, tilføje en ændring eller introducere et patogen. Flasker skal forsegles igen, og gassensorledningen tilsluttes igen, før lysene tændes igen. Iltmålingerne indsamlet fra forsøg med lukkede versus åbne natlige headspaces vil variere.
Når flasker forbliver forseglede, reducerer iltforbruget om natten antallet af molO2 i headspace. Dette får pakningsvæske til at krybe op ad gassensorledningen for at opretholde headspace-trykket. Når lyset tændes, genoptages iltproduktionen. Emballagevæske skal skubbes tilbage i gassensoren, før strømningshastighedsaflæsninger påbegyndes. Denne forsinkelse er derfor proportional med graden af respiration om natten. På denne måde, når headspace forbliver lukket, repræsenterer O 2-aflæsninger netto O2-produktion (fotosyntetisk produktion - respirationsforbrug). Omvendt, når headspace er åbent om natten, erstatter atmosfærisk gas, hvad headspace O2 forbruges, og ingen pakningsvæske kommer ind i gasledningen. Resultatet er, at respiratoriskO2-forbrug ikke tages i betragtning i O2-produktionsdata. Dette kan reducere nøjagtigheden af AFDW-biomassevækstestimater. Det bør dog ikke påvirke nytten af at brugeO2-produktion i dagtimerne som en måling til at sammenligne vækst mellem behandlinger.
Alle PBR-laboratorier er omfattet af den samme begrænsning. kunstige lys kan ikke replikere solspektret. Mikroalger bruger bølgelængder af lys mellem 400-700 nm til fotosyntese. Denne region kaldes fotosyntetisk aktiv stråling (PAR)33. Sollys og kunstigt lys varierer i deres relative bidrag af bølgelængder inden for dette område. Dette sammen med gunstige temperaturer og en konstant lysforsyning betyder, at laboratorievækstdata ofte ikke kan ekstrapoleres pålideligt til udendørs forhold. Disse PBR'er kan dog løse en af begrænsningerne ved laboratoriets PBR-lysforsyning. Sollysintensiteten er meget variabel hele dagen, hvor skydækket genererer forbigående udsving i hændelse PAR. Lysstyringssoftwaren og DMX-lysstyringen kan give lysintensiteter fra 0 til 2400 μmolfotoner m-2 s-1 og derover. Lysregimer kan opdeles i individuelle trin så korte som 1 s. Justerbar lysintensitet giver brugeren mulighed for at efterligne udendørs lysmønstre tættere end standard PBR-opsætninger. Her falmer simulerede 30 minutters daggry- og skumringsintervaller dag og nat cyklusser sammen (supplerende tabel 1).
Selvom AFDW-tæthed er blevet standardmålet for vækst, kan denne metode kræve betydelige kulturvolumener, en 2-3-dages behandlingsperiode og genererer et datapunkt ad gangen. Yderligere, hvis forholdene bliver ugunstige, og celler dør, skelner AFDW-densitet ikke mellem aktivt fotosyntetiserende celler og dem, der nedbrydes. Kvantificering af hastigheden af fotosyntetisk iltproduktion tjener som en alternativ vækstproxy. Dette PBR-design kan registrere iltproduktion kontinuerligt med lidt brugerintervention, samtidig med at kulturvolumen bevares. Dataopløsningen kan forbedres ved at vælge en gassensor med et lavere målecellevolumen, f.eks. 1 ml. Hvis kulturer er godt blandede, kan brugerne desuden beslutte at installere et spektrofotometer til kontinuerlig optisk densitetsaflæsninger. Hvis temperaturregulering af mediet ønskes, kan der tilsættes en recirkulerende køler. Disse PBR'er er en værdifuld tilføjelse til et laboratorium, der ønsker at udvide sin mikroalgeforskningskapacitet uden store økonomiske investeringer. De er særligt velegnede til dem, der arbejder med høj alkalinitet, høj pH-art som Spirulina. Disse PBR'er tilbyder let regimefleksibilitet og er gyldige til hurtige, replikerede laboratorievækstsammenligninger.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC), Canada Foundation for Innovation (CFI), Canada First Research Excellence Fund (CFREF), Alberta Innovates, General Sir John Monash Foundation, Albertas regering og University of Calgary. Tak til Mark Toonen for det elektriske arbejde og William Richardson for opløselighedsberegninger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum channels Imperial: 0.90” x 39.37” Metric: 2.3 cm x 100 cm Quantity: 4 |
LED World | AC-AR1-1M | Required as a heat sink |
| Bungee cords, small Quantity: 5 |
- | - | To secure bottles |
| Computer - desktop/laptop Quantity: 1 |
- | - | - |
| Data Logger, HOBO U30 USB Weather Station Quantity: 1 |
HOBO, Hoskin | U30-NRC-VIA-10-S100-000 | Records light sensor information |
| Digital interface module, Rigamo, 4-channel Quantity: 1 |
Ritter | N/A | This is to transmit gas sensor data to the computer |
| DMX decoder, 12~24 VDC, DMX-CV-4X5A Quantity: 1 |
LITECH, LED World | LT-840-6A | Transmit messages which alter the light pattern |
| DMX lighting controller, SUSHI-RB-RJ Quantity: 1 |
Arcolis, Nicolaudie America Inc. | SUSHI-RB-RJ DMX | Encodes the lighting program |
| Gas sensor packing liquid (Silox) Quantity: 1 L |
Ritter | https://www.ritter.de/en/data-sheets/silox | |
| Gas sensor, volumetric Quantity: 3 |
Ritter | MGC-1 V3.4 PMMA (https://www.ritter.de/downloads/mgc-milligascounter-en) | Measures oxygen production |
| Glass bottles, round 1 L with GL45 neck Quantity: 3 |
Corning, Capitol Scientific | 1395-1L | Culture vessels |
| Hardware - end caps for slotted steel Quantity: 10 |
Paulin, Home Depot | 142-612 | To cover sharp edges of slotted steel |
| Hardware - eye hooks Quantity: 6 |
- | - | To secure bottles |
| Hardware - metal corner braces (large) Imperial: 4" x 4" Metric: 10 cm x 10 cm Quantity: 8 |
- | - | Larger brackets to construct metal stand |
| Hardware - metal corner braces (small) Imperial: 2 1/2" x 2 1/2" Metric: 6.4 cm x 6.4 cm Quantity: 6 |
- | - | Small brackets to connect bottle platforms to PVC pipe |
| Hardware - metal corner gussets Imperial: 3" x 3" Metric: 7.6 cm x 7.6 cm Quantity: 6 |
Paulin, Home Depot | 142-616 | Flat brackets to construct metal stand |
| Hardware - piano hinge Imperial: 36" Metric: 91 cm Quantity: 1 |
- | - | Connects two halves of PVC pipe |
| Hardware - rivets Quantity: 40 |
- | - | To attach piano hinge to PVC tubing |
| Hardware - set of bolts, nuts, washers Quantity: 60 |
- | - | Long thin bolts are required to secure bottle platforms around magentic stirrers |
| Hardware - set of bolts, nuts, washers Quantity: 30 |
- | - | Larger shorter bolts are required to build the metal stand |
| LED driver, constant voltage, 96W 24VDC UL Listed IP65 Driver Class 2 regulated power supply Quantity: 1 |
Magnitude Lighting, LED World | CVN96L24DC | Regulates power to the lights |
| LED lights, Cinco Bright LED Flex Strip Quantity: 4 m roll |
EvenBright, LED World | FA128M57-4M-24V-X | Roll is trimmed into 4 x 1 m lengths and secured inside the PVC tube |
| Light meter, handheld with submersible sperical probe Quantity: 1 |
LI-COR | LA-250A | Calibrate the reactors light intensity |
| Light sensors Photosynthetic Light (PAR) Smart Sensor Quantity: 2 |
HOBO, Hoskin | S-LIA-M003 | Only one is required however two would be good practice in case one malfunctioned |
| Magnetic stirrers (MIXdrive 1 XS) with external control units and power supply (MIXcontrol eco) Quantity: 3 |
2Mag, 2MAG USA | MF 40300 | Stirrers sit sandwiched in bottle platforms |
| Metal plate Imperial: 24" x 8" Metric: 61 cm x 20.3 cm Quantity: 1 |
- | - | This is a surface on which to secure electronics, it is attached to the back of the reactor |
| Pipe, white PVC Imperial: 6" diameter x 42" high Metric: 15.2 cm x 106.7 cm Quantity: 1 |
- | - | Cut lengthwise in two halves, used to house lights and bottles |
| Plastic (HDPE) sheets Imperial: 4" x 4" x 1/4" Metric: 10 cm x 10 cm x 1 cm Quantity: 6 |
Inventables | 30291-01 | For bottle platforms which house magentic stirrers |
| Rubber stoppers - GL45 size Quantity: 3 |
Duran, VWR | 76289-760 | Seals culture vessels |
| Screw caps - with aperture and GL45 neck Quantity: 3 |
Corning, Capitol Scientific | 1395-45HTSC | Generates seal of culture vessels |
| Slotted angle steel lengths Imperial: 1-1/2" X 48" x 0.074" Metric: 3.8 cm x 122 cm x 0.19 cm Quantity: 6 |
Paulin, Home Depot | 142-202 | Makes up the body of the metal stand |
| Slotted flat steel lenghts Imperial: 1-3/8" x 48" x 0.074" Metric: 3.5 cm x 122 cm x 0.19 cm Quantity: 3 |
Paulin, Home Depot | 142-222 | Makes up the body of the metal stand |
| Software - Easy Stand Alone (ESA) | https://www.dmxsoft.com/#apps | AKA LED control software | |
| Software - Rigamo v3.1 | AKA data acquisition software | ||
| Software - Storage Upgrade Tools (SUT) | https://store.dmxsoft.com// | ||
| Stir bar Imperial: 1" x 5/16" Metric: 2.5 cm x 0.8 cm Quantity: 3 |
Fisherbrand | 14-513-59 | Stirs culture |
| Switch box Quantity: 1 |
- | - | Turns power on/off to reactor |
| Syringe, 10 mL Quantity: Multiple |
- | - | Optional if you wish to extract culture |
| Tube adaptor fittings, plastic - Stopcock 1-way Quantity: 6 |
Masterflex, Cole Palmer | RK-12023-33 | Close/open culture vessel line |
| Tube adaptor fittings, plastic - variety of male and female luer lock fittings Imperial: to fit 1/16" and 1/8" ID tubing Metric: to fit 1.59 mm and 3.18 mm tubing Quantity: Multiple packets |
Masterflex, Cole Palmer | RK-30800-16; RK-30800-18; RK-45518-26; RK-45501-00; RK-45501-04 | Many different combinations can achieve the same end result, best to order a variety of fittings |
| Tube adaptor fittings, plastic - variety of straight connectors Imperial: to fit 1/16" and 1/8" ID tubing Metric: to fit 1.59 mm and 3.18 mm tubing Quantity: Multiple packets |
Masterflex, Cole Palmer | RK-40616-04 | Many different combinations can achieve the same end result, best to order a variety of fittings |
| Tubing, flexible, transparent Imperial: ID=1/16", OD=1/8" Metric: ID = 1.59 mm, 0D = 3.18 mm Quantity: 4 m |
Masterflex, Cole Palmer | RK-06422-02 | Line from culture vessel to gas sensor |
| Tubing, flexible, transparent Imperial: ID=1/8", OD=1/4" Metric: ID = 3.18 mm, 0D = 6.35 mm Quantity: 2 m |
Masterflex, Cole Palmer | RK-06422-05 | Gas sensor standard tubing size |
| Tubing, rigid, transparent Imperial: ID=1/16", OD=1/8" Metric: ID = 1.59 mm, 0D = 3.18 mm Quantiy: 1 m |
Masterflex, Cole Palmer | RK-06605-27 | Spans rubber stopper allowing gas to exit |
| Tubing, rigid, transparent Imperial: ID=1/8", OD=1/4" Metric: ID = 3.18 mm, 0D = 6.35 mm Quantity: 1 m |
Masterflex, Cole Palmer | RK-06605-30 | Spans rubber stopper allowing gas to exit |
| Zip ties, small Quantity: 1 packet |
Secure tube fittings |
References
- Benemann, J. R. Opportunities and challenges in algae biofuels production. A position paper in line with Algae World. , (2008).
- Laurens, L. M. L. State of technology review - algae bioenergy. An IEA bioenergy inter-task strategic project. IEA Bioenergy. , (2017).
- Robertson, D. E., et al. A new dawn for industrial photosynthesis. Photosynthesis Research. 107, 269-277 (2011).
- Troschl, C., Meixner, K., Drosg, B. Cyanobacterial PHA production-review of recent advances and a summary of three years' working experience running a pilot plant. Bioengineering. 4 (2), (2017).
- Rizwan, M., Mujtaba, G., Memon, S. A., Lee, K., Rashid, N. Exploring the potential of microalgae for new biotechnology applications and beyond: a review. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 92, 394-404 (2018).
- Niesa, F., et al. Characterization of Phormidium lacuna strains from the North Sea and the Mediterranean Sea for biotechnological applications. Process Biochemistry. 59, 194-206 (2017).
- Laurens, L. M. L., Chen-Glasser, M., McMillan, J. D. A perspective on renewable bioenergy from photosynthetic algae as feedstock for biofuels and bioproducts. Algal Research. 24, 261-264 (2017).
- Barreiro-Vescovo, S., Barbera, E., Bertucco, A., Sforza, E. Integration of microalgae cultivation in a biogas production process from organic municipal solid waste: From laboratory to pilot scale. ChemEngineering. 4 (2), 26 (2020).
- Zurano, A. S., et al. Year-long assessment of a pilot-scale thin-layer reactor for microalgae wastewater treatment. Variation in the microalgae-bacteria consortium and the impact of environmental conditions. Algal Research. 50, (2020).
- Deprá, M. C., Severo, I. A., Dias, R. R., Zepka, L. Q., Jacob-Lopes, E. Photobioreactor design for microalgae culture. Microalgae. , Elsevier. 35-61 (2021).
- Osburn, F. S., Wagner, N. D., Scott, J. T. Biological stoichiometry and growth dynamics of a diazotrophic cyanobacteria in nitrogen sufficient and deficient conditions. Harmful Algae. 103, (2021).
- Eustance, E., Badvipour, S., Wray, J. T., Sommerfeld, M. R. Biomass productivity of two Scenedesmus strains cultivated semi-continuously in outdoor raceway ponds and flat-panel photobioreactors. Journal of Applied Phycology. 28 (3), 1471-1483 (2016).
- Qiang, H., Richmond, A., Zarmi, Y. Combined effects of light intensity, light-path and culture density on output rate of spirulina platensis (cyanobacteria). European Journal of Phycology. 33 (2), 165-171 (1998).
- Ooms, M. D., Dinh, C. T., Sargent, E. H., Sinton, D. Photon management for augmented photosynthesis. Nature Communications. 7, 1-13 (2016).
- Moheimani, N. R., Borowitzka, M. A., Isdepsky, A., Sing, S. F. Standard methods for measuring growth of algae and their composition. Algae for biofuels and energy. , Springer. Dordrecht. 265-284 (2013).
- Griffiths, M. J., Garcin, C., van Hille, R. P., Harrison, S. T. L. Interference by pigment in the estimation of microalgal biomass concentration by optical density. Journal of Microbiological Methods. 85 (2), 119-123 (2011).
- Schumann, R., Häubner, N., Klausch, S., Karsten, U. Chlorophyll extraction methods for the quantification of green microalgae colonizing building facades. International Biodeterioration and Biodegradation. 55 (3), 213-222 (2005).
- Pinckney, J. L., Richardson, T. L., Millie, D. F., Paerl, H. W. Application of photopigment biomarkers for quantifying microalgal community composition and in situ growth rates. Organic Geochemistry. 32 (4), 585-595 (2001).
- Van Wychen, S., Laurens, L. M. L. Determination of total solids and ash in algal biomass: laboratory analytical procedure (LAP). National Renewable Energy Laboratory. , Golden, CO. (2015).
- Davis, R., Laurens, L. Algal biomass production via open pond algae farm cultivation: 2019 state of technology and future research. National Renewable Energy Laboratory. , Golden, CO. (2020).
- Borovkov, A. B., Gudvilovich, I. N., Avsiyan, A. L. Scale-up of Dunaliella salina cultivation: from strain selection to open ponds. Journal of Applied Phycology. 32 (3), 1545-1558 (2020).
- Davies, F. K., et al. Microbiota associated with the large-scale outdoor cultivation of the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002. Algal Research. 58, (2021).
- Ataeian, M., et al. Direct capture and conversion of CO2 from air by growing a cyanobacterial consortium at pH up to 11.2. Biotechnology and Bioengineering. 116 (7), 1604-1611 (2019).
- Fu, F., et al. Sustained photosynthesis and oxygen generation of microalgae-embedded silk fibroin hydrogels. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2021).
- Rearte, T. A., et al. Photosynthetic performance of Chlorella vulgaris R117 mass culture is moderated by diurnal oxygen gradients in an outdoor thin layer cascade. Algal Research. 54, (2021).
- Poughon, L., et al. Limnospira indica PCC8005 growth in photobioreactor: model and simulation of the ISS and ground experiments. Life Sciences in Space Research. 25, 53-65 (2020).
- Yen, U. C., Huang, T. C., Yen, T. C. Observation of the circadian photosynthetic rhythm in cyanobacteria with a dissolved-oxygen meter. Plant Science. 166 (4), 949-952 (2004).
- Vermaas, W. F.
- Ritter, MilliGascounter Type MGC-1 Operation Instructions V 3.4. , (2017).
- Sousa, C., De Winter, L., Janssen, M., Vermuë, M. H., Wijffels, R. H. Growth of the microalgae Neochloris oleoabundans at high partial oxygen pressures and sub-saturating light intensity. Bioresource Technology. 104, 565-570 (2012).
- Latifi, A., Ruiz, M., Zhang, C. C.
- Morillas-España, A., Lafarga, T., Gómez-Serrano, C., Acién-Fernández, F. G., González-López, C. V. Year-long production of Scenedesmus almeriensis in pilot-scale raceway and thin-layer cascade photobioreactors. Algal Research. 51, (2020).
- Melis, A. Solar energy conversion efficiencies in photosynthesis: minimizing the chlorophyll antennae to maximize efficiency. Plant Science. 177 (4), 272-280 (2009).
