Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Bestemmelse af mitokondrie respiration og glykolyse i Ex Vivo Retinal vævsprøver

Published: August 4, 2021 doi: 10.3791/62914
Automatic Translation
1, 1, 1
1Neurobiology, Neurodegeneration & Repair Laboratory, National Eye Institute, National Institutes of Health

Summary

Beskrevet her er en detaljeret protokol for udførelse mitokondrie stress assay og glykolytisk sats assay i ex vivo retinal væv prøver ved hjælp af en kommerciel bioanalyzer.

Abstract

Mitokondrie respiration er en kritisk energi-genererende vej i alle celler, især retinale fotoreceptorer, der besidder en meget aktiv metabolisme. Derudover udviser fotoreceptorer også høj aerob glykolyse som kræftceller. Præcise målinger af disse metaboliske aktiviteter kan give værdifuld indsigt i cellulære homøostase under fysiologiske forhold og i sygdomstilstande. Høj gennemløb mikroplade-baserede assays er blevet udviklet til at måle mitokondrie respiration og forskellige metaboliske aktiviteter i levende celler. Langt de fleste af disse er imidlertid udviklet til kultiverede celler og er ikke blevet optimeret til intakte vævsprøver og til påførings ex vivo. Beskrevet her er en detaljeret trin-for-trin protokol, ved hjælp af mikroplade-baseret fluorescens teknologi, til direkte at måle iltforbrug sats (OCR) som en indikator for mitokondrie respiration, samt ekstracellulær forsuring sats (ECAR) som en indikator for glykolyse, i intakt ex vivo retinal væv. Denne metode er blevet brugt til at vurdere metaboliske aktiviteter i voksne mus nethinden og demonstrere dens anvendelse i at undersøge cellulære mekanismer af aldring og sygdom.

Introduction

Mitokondrier er essentielle organelle, der regulerer cellulære metabolisme, signalering, homøostase, og apoptose ved at koordinere flere afgørende fysiologiske processer1. Mitokondrier tjene som kraftcenter i cellen til at generere adenosin triphosphat (ATP) gennem oxidativ fosforylering (OXPHOS) og give energi, der understøtter næsten alle cellulære begivenheder. Størstedelen af cellulær ilt metaboliseres i mitokondrier, hvor det tjener som den endelige elektron acceptor i elektron transportkæden (ETC) under aerob respiration. Lave mængder ATP kan også fremstilles af glykolyse i cytosolen, hvor glukose omdannes til pyruvat, som yderligere kan omdannes til laktat eller transporteres til mitokondrier og oxideres til acetyl-CoA, et substrat i tricarboxylsyrecyklussen (TCA-cyklus).

Nethinden er en af de mest metabolisk aktive væv i pattedyr2, viser høje niveauer af mitokondrie respiration og ekstremt højt iltforbrug3. Stangen og kegle fotoreceptorer indeholder en høj densitet af mitokondrier4, og OXPHOS genererer de fleste ATP i nethinden5. Derudover er nethinden også stærkt afhængig af aerob glykolyse6,7 ved at konvertere glukose til laktat5. Mitokondrie defekter er forbundet med forskellige neurodegenerative sygdomme8,9; og med sine unikke høje energibehov er nethinden særligt sårbar over for metaboliske defekter, herunder dem, der påvirker mitokondrie OXPHOS4 og glykolyse10. Mitokondrie dysfunktion og defekter i glykolyse er impliceret i retinal11,12 og makula13 degenerative sygdomme, aldersrelaterede makuladegeneration10,14,15,16, og diabetisk retinopati17,18. Derfor kan nøjagtige målinger af mitokondrie respiration og glykolyse give vigtige parametre til vurdering af nethindens integritet og sundhed.

Mitokondrie respiration kan måles ved bestemmelse af iltforbrug sats (OCR). Da omdannelsen af glukose til pyruvat og efterfølgende til laktat resulterer i ekstrudering af protoner til og forsuring af det ekstracellulære miljø, giver målinger af den ekstracellulære forsuringshastighed (ECAR) en indikation af glykolysestrøm. Da nethinden består af flere celletyper med intime relationer og aktiv synergi, herunder udveksling af substrater6, er det bydende nødvendigt at analysere mitokondriefunktion og metabolisme i forbindelse med hele retinal væv med intakt laminering og kredsløb. I de sidste mange årtier er Clark type O2 elektroder og andre iltmikroelektroder blevet brugt til at måle iltforbruget i nethinden19,20,21. Disse iltelektroder har store begrænsninger i følsomhed, krav om et stort prøvevolumen og behovet for kontinuerlig omrøring af suspenderende prøve, hvilket normalt fører til afbrydelse af cellulær og vævskontekst. Protokollen beskrevet her blev udviklet ved hjælp af en mikroplade-baseret, fluorescens teknik til at måle mitokondrie energi metabolisme i frisk dissekeret ex vivo mus nethinden væv. Det giver mulighed for mid-throughput real-time målinger af både OCR og ECAR samtidig ved hjælp af en lille prøve (1 mm punch) af ex vivo retinal væv og samtidig undgå behovet for suspension og kontinuerlig omrøring.

Demonstreret her er den eksperimentelle procedure for mitokondrie stress assay og glykolytisk sats assay på frisk dissekeret retinal punch diske. Denne protokol gør det muligt at måle mitokondrier-relaterede metaboliske aktiviteter i en ex vivo væv sammenhæng. Forskellig fra de analyser, der udføres ved hjælp af kultiverede celler, afspejler de aflæsninger, der opnås her, kombineret energimetabolisme på vævsniveau og påvirkes af interaktioner mellem de forskellige celletyper i vævet. Protokollen er ændret fra en tidligere offentliggjort version22,23 for at tilpasse sig den nye generation af Agilent Seahorse ekstracellulær flux 24-brønde (XFe24) analysator med Islet Capture plade. Analysen medium, injektion sammensatte koncentrationer, og antallet / varigheden af assay cyklusser er også blevet optimeret til nethindevæv. En detaljeret trin-for-trin protokol er givet til udarbejdelse af retinale punch diske. Mere information om programopsætning og dataanalyse kan fås ved henvendelse til producentens brugervejledning24,25,26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle museprotokoller blev godkendt af Udvalget for Dyrepleje og Anvendelse under National Eye Institute (NEI ASP# 650). Mus blev anbragt i 12 h lyse mørke forhold og plejet ved at følge anbefalingerne i vejledningen for pleje og brug af laboratoriedyr, Institute of Laboratory Animal Resources og Public Health Service Policy on Human Care and Use of Laboratory Animals.

1. Fugtgivende sensorpatron og tilberedning af analysemediet

  1. Dagen før eksperimentet tilsættes 1 mL kalibreringsmediet til hver brønd i brugspladen. Placer Hydro-Booster-dækslet øverst, og sænk sensorpatronen gennem åbningen på dækslet. Kontroller, at sensoren er nedsænket i kalibreringsmediet. Inkuber sensorpatronen natten over i en CO2-fri inkubator ved 37 °C for at aktivere fluorophorerne.
    BEMÆRK: For at undgå fordampning befugtes inkubatoren ved at holde en bakke vand inde, og sensorkassettekassetten er pakket ind med klar plastfolie.
  2. Tilbered analysemediet ved at rekonstituere Seahorse DMEM-mediet med tilsætning af glukose, pyruvat og glutamin til de ønskede koncentrationer. I de analyser, der er rapporteret i denne artikel, er den endelige koncentration af substrater i analysemediet: 6 mM glukose, 0,12 mM pyruvat og 0,5 mM glutamin. For hver analyseplade fremstilles 40 mL af analysemediet frisk på dagen for eksperimentet.
  3. Konfigurer analyseprogrammet i analysator efter producentens instruktion26. I analysen demonstreret her, protokollen er indstillet som følger: 5 cyklusser af målinger for baseline, derefter injicere port A, efterfulgt af 4 cyklusser af målinger, derefter injicere port B og efterfulgt af 4 cyklusser af målinger. Hver cyklus består af mix (3 min), vent (2 min) og mål (3 min).

2. Belægning mesh skær af holm fange mikroplade

  1. Belægningsblandingen forberedes ved at kombinere 20 μL af celletilbehørsmediet (f.eks. Cell-Tak) med 171 μL på 0,1 M natriumbicarbonat og 9 μL på 1 M NaOH.
  2. Åbn låget på kassettebåndbåndene, der indeholder netindsatser. Pipette 8 μL af belægningsblandingen til hver maskeindsats. Brug en pipettespids til forsigtigt at smøre/sprede dråben rundt for at fordele belægningsblandingen ligeligt i hele netindsatsen.
  3. Luk kassetten og lad netindsatserne inkubere ved stuetemperatur i mindst 25 minutter for adsorption.
  4. Netindsatsen vaskes ved at pipetter analysemediets 4 mL direkte på netindsatserne. Ryst forsigtigt kassetten for at sikre, at alle netindsatser vaskes med analysemediet.
  5. Hold maskeindsatsen til side. Den er klar til brug.

3. Forberedelse af injektionsforbindelser

  1. Tag lager aliquots af Bam15 (10 mM), Rotenone (10 mM), Antimycin A (10 mM) og 2-DG (500 mM) fra -80 °C fryser og tø ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: 2-DG-aktien er klar til brug. De andre lægemidler skal fortyndes til arbejdsmassen.
  2. 10 mL af analysemediet opvarmes i et 37 °C vandbad.
  3. Fortynd 10 mM Bam15 lager til 50 μM arbejdslager ved hjælp af en to-trins fortyndingsprocedure: bland 20 μL på 10 mM lager med 20 μL DMSO for at få 5 mM mellemlager. Bland derefter 10 μL af ovennævnte 5 mM mellemlager med 990 μL forvarmet analysemedium for at få den endelige 50 μM arbejdsmasse.
  4. Fortynd og kombiner 10 mM Rotenone og 10 mM Antimycin En bestand til 10 μM Rotenone/Antimycin A (Rot/AA) arbejdslager med to trin fortyndinger: bland 10 μL hver af 10 mM Rotenone og 10 mM Antimycin En bestand med 80 μL DMSO for at få 1 mM Rot/AA mellemlager. Bland derefter 10 μL af ovennævnte 1 mM mellemlager med 990 μL forvarmet analysemedium for at få den endelige 10 μM Rot/AA arbejdsmasse.
  5. Friskforbered de ovennævnte arbejdslagre af injektionsforbindelser på dagen for eksperimentet og sæt dem til side ved stuetemperatur, indtil de indlæses i sensorpatronens injektionsporte.

4. Retinal dissektion og retinal punch forberedelse

  1. Aflive en mus ved CO2 kvælning efter AVMA retningslinjer om aktiv dødshjælp27.
    BEMÆRK: Lad ikke dyret stå i et CO2-kammer længere end den tid, der er nødvendig for aktiv dødshjælp.
  2. Enucleate øjne og sted i is-gamle 1x PBS buffer i en Petri-parabol og derefter placere den under en dissektion mikroskop.
  3. Fjern forsigtigt, ved at skære med mikroscissorer, de ekstra rectusmuskler fastgjort uden for øjeæblet og afskær synsnerven.
  4. Brug en 30 G nål til at slå et hul på kanten af hornhinden (limbus); dette tjener som indsætningssted for mikroscissorer. Brug derefter en fin dissektion mikroscissorer til at lave et cirkulært snit langs kanten af hornhinden, adskille det fra den bageste øje kop.
  5. Brug skarpe dissektionstaktrer til at fjerne hornhinden, linsen og glaslegemet humor væk fra øjenbægeret.
  6. Brug fine dissektion mikroskelsorer til at gøre flere små nedskæringer på det scleral lag på kanten af øjet kop. Undgå at skære i nethinden lag. Brug to skarpe dissektions-sammentrækningsdekationer til at holde fast i det sclerale væv på hver side af snittet og træk meget forsigtigt på det sclerale lag for at fjerne det fra neural nethinden. Gentag dette omkring øjet kop, indtil alle sclera er fjernet, og en intakt retinal kop er opnået.
  7. Brug dissektion mikroscissorer og gøre radiale nedskæringer på retinal kop til at flade det og generere flere forskellige sektioner.
    BEMÆRK: Afhængigt af personens dissektion færdigheder og erfaring i håndtering af frisk retinal væv, kan retinal kop skæres til at generere 3 til 5 forskellige sektioner.
  8. Brug biopsistans med en diameter på 1 mm til at skære en nethindesk disk ud af hver sektion af den flade nethindekop.
    BEMÆRK: Man skal være opmærksom på at få retinale diske slået i lige afstand fra synsnerven hovedet.
  9. Brug sammenkr vil overføre de forbelagte netindsatser til dissekeringsdældningsskålen. Placer nethindens stanseskive på netkraftindsatsen ved hjælp af to superfine øjenvipperbørster. Nethinden punch disk er placeret i midten af mesh indsætte med ganglion celle lag side ned rører mesh og photoreceptor lag vender op.
    BEMÆRK: Ofte forbliver nogle RPE-celler fastgjort til fotoreceptorerne, og pigmenteringen af disse celler kan bruges som indikator for nethindens stanseretning.

5. Indlæser sensorpatronens injektionsporte og kalibrering

  1. Tag den hydrerede sensorpatronpladekassette ud af inkubatoren på 37 °C. Fjern Hydro-Booster-dækslet, og anbring sensorpatronen på brugspladen igen.
  2. Læg den ønskede mængde indsprøjtningsblandingsløsninger i passende porte. Hold pipettespidsen i 45 ° vinkel. Sæt pipettespidsen halvvejs ind i en injektionsport med spidsens facet mod den modsatte væg i injektionsporten, og læg forsigtigt forbindelsen i hver port. Undgå at indføre luftbobler.
  3. Der henvises til instrumentbrugervejledningen for mængden af den forbindelse, der er indlæst i hver injektionsport, for en bestemt analyse. I de i dette dokument præsenteres 68 μL på 50 μM Bam15 arbejdslager (til mitokondriestressanalyse) eller 68 μL på 10 μM Rot/AA-arbejdslager (til glykolytisk rateanalyse) i port A; 75 μL af 10 μM Rot/AA arbejdslager (til mitokondriestresanalyse) eller 75 μL på 500 mM 2-GD arbejdslager (til glykolytisk rateanalyse) lægges i port B.
  4. Belastning injektion porte af alle brønde af pladen, herunder baggrundskorrektion brønde og tomme brønde for at sikre korrekt injektion. Indlæs den respektive sammensatte opløsning i hver port til baggrundskorrektions brønde. Assay medium kan erstattes, i stedet for den sammensatte løsning, i hver af havnene i banken brønde.
  5. Anbring den indlæste sensorpatronplade, med låget slukket, i analysatormaskinen for at starte kalibreringen før analysekørslen. Når kalibreringen er overstået, vil programmet automatisk pause, venter på udskiftning af nyttepladen med holmen fange plade, der indeholder retinale slag.

6. Lastning af holmens opsamlingsplade og start af analysekørsel

  1. Der tilsættes 607 μL af analysemediet til hver brønd af holmens opsamlingsplade
  2. Brug sammentak til at få fat i kanten af mesh indsætte indeholder retinale punch diske på toppen og tage det ud fra Petri-parabol. Tryk let på bunden af maskeindsatsen på et absorberende tørrevæv for at fjerne ekstra væske og læg den i brønden af øens opsamlingsplade. Gentag dette trin, indtil alle mesh skær med retinale slag er placeret i holmen fange plade. Fyld baggrundskorrektions brønde og tomme brønde med tomme netindsatser.
  3. Brug to Graefe-sammenkrøpper til omhyggeligt og forsigtigt at trykke på kanten af hver maskeindsats og sørg for, at disse er sikkert indsat i bunden af holmens opsamlingsplade.
  4. Anbring den lastede holmfangeplade i en inkubator på 37 °C i 5 minutter for at varme op.
  5. Skub hjælpepladen ud, når kalibreringen er færdig, og udskift den med en og udskift den med holmoptagelsespladen med låg af, der indeholder retinale slag.
  6. Genoptag analysen.

7. Kør opsigelse og datalagring

  1. Når kørslen er færdig, skubbe sensorpatronen og holmen fange plade, der indeholder retinale slag. Dataene gemmes automatisk som .asyr-fil.
  2. Brug den tilknyttede dataanalysesoftware til at få vist og analysere dataene efter producentens brugervejledning26.
  3. Brug funktionen Eksporter til at eksportere .xslx-filen for dataene, som kan ses og analyseres ved hjælp af regnearkssoftware.

8. Lagring af nethinden punch prøve

  1. Efter analysen skal du tage pladen ud af maskinen, fjerne sensorpatronen og forsigtigt fjerne analysemediet fra hver brønd ved hjælp af en pipette.
  2. Påfør dækslet på igen og forsegl siderne af pladen med parafilmstrimlen.
  3. Opbevares ved -80 °C.
  4. For normalisering, kvantificere det samlede DNA eller proteinindhold af punch i hver brønd.

9. Dataanalyse

  1. Mitokondrie stress assay
    BEMÆRK: Den målte OCR-værdi (totalOCR) repræsenterer vævets samlede iltforbrug. Efter Bam15 (uncoupler) injektion, OCR stiger fra det basale niveau (totalOCRbasal) til det maksimale niveau (totalOCRmax) og går ned efter Rot / AA injektion. Den resterende OCR-værdi efter Rot/AA-injektion (totalOCRRot/AA) repræsenterer ikke-mitokondrie oxygenforbrug.
    1. Beregn mitokondrier-relateret iltforbrug som:
      Equation 1 (Eq. 1) 28
    2. Beregn mitokondriereservekapaciteten (MRC) som:
      Equation 2 (Eq. 2) 29
      BEMÆRK: Den sidste aflæsning blandt de 5 målinger før Bam15-injektionen tages som "basal" værdi (for totalOCRbasal og mitoOCRbasal). Den højeste aflæsning blandt de 4 målinger efter Bam15 injektion anvendes som "max" værdi (for totalOCRmax og mitoOCRmax). Den laveste aflæsning blandt de 4 målinger efter Rot/AA-injektionen anvendes som totalOCRRot/AA.
  2. Glykolytisk sats assay
    BEMÆRK: Den målte ECAR-værdi (totalECAR) repræsenterer den samlede forsuring af mediet ved vævets metaboliske aktivitet. Generelt resulterer forsuring af det ekstracellulære mikromiljø hovedsageligt ved ekstrudering af det glykolytiske produkt, laktat. Katabolisme af substrater i mitokondrie TCA cyklus resulterer i produktion af CO2, som også forsurer den ekstracellulære medium gennem hydrering til bikarbonat.
    1. Substract mitokondrie bidrog medium forsuring (mitoECAR) fra totalECAR at opnå glycoECAR.
      Equation 3 (Eq. 3) 28
      BEMÆRK: Mitokondrie respiration og TCA cyklus er stærkt koblet processer. Produktion af CO2 fra mitokondrier er en funktion af satsen for OXPHOS, som kan måles af mitoOCR.
    2. Beregn mitoECAR som:
      Equation 4 (Eq. 4) 28
      hvor CCF (CO2 Contribution Factor) er en empirisk beregnet ratioværdi, der repræsenterer mængden af H+ -bidrag fra CO2-medieret forsuring i forhold til hvert O2-forbrug fra OXPHOS. CCF for dette system er på forhånd bestemt til at være 0,6028. Nøjagtig måling af medium forsuring bestemmes af mediets bufferkapacitet, følsomheden af instrumentets pH-sensor og den effektive målekammerkapacitet. Her er BF (Buffer Factor) en parameter for in situ eksperimentel bufferkapacitet, der repræsenterer mængden af H + eller OH- tilføjet til det effektive målekammer for at ændre pH-niveauet med 1 enhed. Når der anvendes tilpasset analysemedium, kan BF bestemmes ved at titrere kendte mængder syre i analysemediet efter bufferfaktorprotokollen30. Seahorse DMEM medium pH 7.4, der anvendes i denne protokol, har en forudbestemt BF på 2,60 mmol H+/L/pH. Den holmfangeplade, der anvendes i denne protokol, har et volmicrochamber = 16,6 μL31. Volumenskaleringsfaktoren Kvol er en empirisk bestemt konstant. Kvol-værdien er ikke tilgængelig for holmfangepladen, men kan beregnes ud fra værdien af mikropladen28, der tegner sig for volumenforskellen i deres mikrokamre, til 0,41.
      BEMÆRK: Injektion af Rot/AA lukker mitokondrie respiration og tvinger vævet til at skifte til glykolyse til ATP-produktion, hvilket fører til højere laktat ekstrudering og en stigning i ECAR måling. Glykolyse ophøres med 2-DG-injektion, og den resterende ECAR-måling afslører ikke-glykolytisk og ikke-mitokondrieforsuring af medium.
    3. Beregn den glykolytiske reservekapacitet (GRC) som:
      Equation 5 (Eq. 5) 32
      hvor den sidste aflæsning blandt de 5 målinger før Rot/AA-injektion tages som "basal" værdi (glycoECARbasal). Den højeste aflæsning blandt de 4 målinger efter Rot/AA-injektion anvendes som "max" værdi (glycoECARmax). Den laveste aflæsning blandt de 4 målinger efter 2-DG injektion anvendes som glycoECAR2-DG.
  3. Normalisering
    BEMÆRK: Normalisering er afgørende, når aflæsninger fra nethindevæv i forskellige aldersgrupper eller mellem vilde og patologiske/ degenerative prøver, som kan variere i celletal.
    1. Brug commerically tilgængelige kits til at vurdere DNA-indholdet i hver retinal punch disk33,34.
    2. Alternativt kan du bruge radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA buffer) til at udtrække det samlede protein fra nethinden punch og bruge proteinindholdet til normalisering.
      BEMÆRK: Overfladearealet af en voksen musehinder er tidligere blevet bestemt til at være omkring 20 mm2, og hver nethinde indeholder ~ 6,5 millioner celler35. Derfor er hver 1 mm diameter retinal punch ~ 1/25 af en enkelt nethinde og indeholder ~ 260K celler. Man kan henvise til disse tal, når man sammenligner data fra en retinal punch til dem fra andre vævsprøver eller dyrkede celler,

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De data, der er rapporteret her, er repræsentativ mitokondriestresanalyse, der viser OCR-spor (figur 1) og glykolytisk satsanalyse, der viser OCR-spor og ECAR-spor (figur 2), som blev udført ved hjælp af frisk dissekerede 1 mm retinale punch diske fra 4 måneder gamle transgene Nrl-L-EGFP mus36 (C57B/L6 baggrund). Disse mus udtrykker GFP specifikt i stang fotoreceptorer uden at ændre normal retinal udvikling, histologi, og fysiologi og har været meget udbredt som vilde-type kontrol i retinal forskning. To Nrl-L-GFP littermate mus blev brugt blev brugt i de analyser, der præsenteres her. GFP udtrykt i Nrl-L-GFP mus forstyrrer ikke målingerne af OCR og ECAR i denne protokol. Fem nethindeslag blev taget fra hver nethinde. Ti af de retinale slag blev brugt til mitokondrie stress assay og de andre 10 blev brugt til glykolytisk sats assay. Seahorse XF DMEM medium, pH 7.4 (konstitueret med 6 mM glukose, 0,12 mM pyruvat og 0,5 mM glutamin) og Seahorse XFe24 Islet Capture plader blev brugt i forsøgene. De repræsentative data, der præsenteres her, blev opnået ved hjælp af den samme puncher med en diameter på 1 mm, men blev ikke normaliseret med hensyn til DNA/proteinindholdet.

I mitokondriestresanalyse blev uncoupler Bam1537 injiceret efter etableringen af OCR-baseline, hvilket førte til forbedret OCR til det maksimale niveau. Rotenone og Antimycin A blev injiceret for at hæmme mitokondrier respiration på komplekse I og komplekse III, henholdsvis hvilket resulterer i OCR til at falde til det minimale niveau (Figur 1). Forskellen mellem ocr's maksimale niveau og den sidste måling af det basale OCR-niveau afspejler mitokondriereservekapaciteten (MRC). MRC beregnes til at være 19,2% ±3,4% ved hjælp af Eq. 2, i overensstemmelse med tidligere målte MRC-værdier i nethinder på ~ 3 måneder gamle Nrl-L-EGFP mus ved hjælp af den tidligere generation Seahorse XF24 analysator22,38.

I den glykolytiske rateanalyse blev Rotenone og Antimycin A injiceret efter at have fastlagt basislinjen for den samlede ECAR. Med produktionen af ATP fra OXPHOS standset, er vævet tvunget til at stole på glykolyse til energi, og en stigning i den ekstracellulære frigivelse af laktat drev ECAR til det maksimale niveau. Glykolyse ophøres ved injektion af 2-DG, som konkurrerer med glukose for hexokinasebinding, hvilket får ECAR til at falde til det minimale niveau (figur 2). Mitokondrier bidraget ECAR (mitoECAR) kan beregnes ud fra mitoOCR-værdien (Eq. 4). Glykolyse bidraget ECAR glycoECAR beregnes og plottes ved at trække mitoECAR fra totalECAR. Forskellen mellem det maksimale niveau af glycoECAR og den sidste måling af glycoECAR basalt niveau afspejler glykolysereservekapaciteten (GRC). Her er GRC beregnet til at være 35,7% ± 3,4% ved hjælp af Eq. 5.

Som et meget glykolytisk væv tegner laktatproduktionen fra nethinden sig for en vigtig kilde til ekstracellulær forsuring, som det fremgår af den lille forskel af glycoECAR fra totalECAR. Interessant nok plateauer ECAR-målingen ikke umiddelbart efter Rot/AA-injektionen, men falder efter den anden måling. Nethinden punch disk er en intakt ex vivo system bestående af forskellige celletyper, herunder Müller glia celler, som er kendt for at modtage laktat (glykolyse slutprodukt) frigivet fra fotoreceptorer6. Derfor kan et fald i ECAR-målingen efter Rot/AA-injektionen sandsynligvis forklares ved øget fjernelse af laktat fra det intercellulære rum, hvilket bremser/forhindrer dets udsætning i mediet.

Figure 1
Figur 1: Mitokondrie stress assay. Den afbildede graf viser OCR spor fra 1 mm retinal punch diske i Seahorse XF DMEM buffer, suppleret med 6 mM glukose, 0,12 mM pyruvat og 0,5 mM glutamin. Hvert datapunkt repræsenterer gennemsnittet af målinger fra 10 brønde. Fejllinje = standardfejl. MRC beregnes til at være 19,2%±3,4%. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Glykolytisk rate assay. Den afbildede graf viser det målte OCR-spor, ECAR-spor (totalECAR), og den beregnede glykolyse bidrog ecar (glycoECAR) fra 1 mm retinal punch diske i Seahorse XF DMEM buffer suppleret med 6 mM glukose, 0,12 mM pyruvat og 0,5 mM glutamin. Hvert datapunkt repræsenterer gennemsnittet af målinger fra 10 brønde. Fejllinje = standardfejl. GRC er beregnet til at være 35,7% ±3,4% Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forudsat her er detaljerede instruktioner til udførelse af mikroplade-baserede analyser af mitokondrie respiration og glykolyse aktivitet ved hjælp af ex vivo, frisk dissekeret retinal punch diske. Protokollen er optimeret til: 1) sikre brugen af et egnet analysemedium til ex vivo retinal væv; 2) anvende korrekt størrelse af retinale punch diske til at opnå OCR og ECAR aflæsninger, der falder inden for maskinens optimale detektionsområde; 3) belægning mesh skær for at forbedre klæbeevnen af retinal punch for stabil læsning i løbet af målecyklussen; 4) brug af optimal koncentration af hver injiceret stofforbindelser; og 5) sikre ændret cyklus længde for at nå et plateau af mitokondrie stater på hvert trin. Reagenserne og protokollen er blevet ændret fra en tidligere udgivet version23 for at tilpasse sig den nye generation seahorse XFe24-maskine. I stedet for Ames 'buffer, der anvendes i den foregående protokol23, en grundlæggende Seahorse DMEM medium bruges her til at tillade den brugerdefinerede forfatning af brændselskilde ved at tilføje glutamin, og pyruvat separat. Dette gør det også muligt at udføre forskellige analyser, hvor et bestemt brændstofsubstrat leveres eller fratages mediet. I de analyser, der præsenteres her, blev mediet konstitueret til samme koncentration af glukose (6 mM), glutamin (0,5 mM) og pyruvat (0,12 mM) som i Ames' buffer, som er bevist egnet til retinal væv. En anden fordel ved dette medium (med 5 mM HEPES) over Ames's buffer (med 22,6 mM NaHCO3) er dens lave bufferkapacitet, som sikrer følsom og præcis måling af ECAR28.

Både mitokondrie stress og glykolytisk sats assays kan udføres efter protokollen beskrevet her med høj præcision, som det fremgår af den stramme standard fejlværdier mellem replikerende brønde. Det er dog værd at bemærke de faktorer, der kan bidrage til datavariation. Undgå celledød i nethindevæv. Hele dissektionsprocessen skal udføres i iskold 1x PBS, og processen fra indsendelse af øjne til at sætte holmfangeplade, der indeholder nethinden, bør ikke overstige 2 timer. Forsigtighed bør tages under dissektion af nethinden kop for at undgå skader på nethinden væv, og slag bør ikke tages fra områder beskadiget af dissektion. Nye, skarpe biopsi puncher bør anvendes i hvert eksperiment, og ændre puncher, når kanten er kedelig eller bøjet for at sikre konsistens og nøjagtighed i skære retinale slag på 1 mm diameter. Prøv at få retinale diske slået på lige langt fra synsnerven hovedet for at undgå regionale variationer (center versus perifer). Efter analysen, kontrollere hver brønd for ethvert tegn på nethinde punch bliver løsrevet fra mesh indsætte. Når en retinal punch har dårlig vedhæftning på mesh indsætte eller løsner under måling, afstanden fra senser sonde til vævet vil ændre sig, påvirker aflæsninger. Udelade data fra sådanne brønde med løsrevet retinal punch.

Måling af real-time mitokondrie metabolisme i intakt retinal væv har brede anvendelser og kan give nyttige oplysninger til forskellige undersøgelser. Disse analyser er blevet brugt til at måle mitokondrie respiration i retinale væv fra mus af forskellige genetiske baggrunde til at afsløre deres iboende forskel i mitokondrie aktivitet39,40. Det blev også brugt til at studere ændringer i mitokondrie energi metabolisme under aldring af nethinden38. Ved at give forskellige brændstof substrater og udnytte forskellige hæmmere rettet mod forskellige metaboliske veje, det giver indsigt i præferencen af cellen / væv på visse brændstofkilder22,38. Desuden kan sammenligning på OCR og MRC mellem vilde muse- og musemodeller af nedarvet retinal degeneration give bevis for mitokondriefejl i degenererende retina22.

Der er begrænsninger ved denne teknik. Den holm capture plade, der anvendes i disse assays indeholder kun 24 brønde; derfor er det kun i stand til at levere mid-throughput analyse. Datakvaliteten fra denne metode er betinget af kvaliteten af retinale punch diske og levedygtighed af celler. Også, retinal dissektion og retinal punch diske forberedelse er en tidskrævende proces, hvilket gør det mindre muligt at high-throughput analyse på levende ex vivo retinal væv, selv når 96-brønd plader er tilgængelige. Sammenlignet med en monolayer af kultiverede celler påvirker indtrængen af lægemiddelforbindelser i nethindens væv også dataudlæsning. Derudover repræsenterer de målte OCR- og ECAR-værdier hele vævets samlede ydeevne, som består af mange forskellige celletyper; derfor er man nødt til at overveje forholdet og interaktioner mellem forskellige neuronale og glialceller i nethinden, mens man fortolker dataene. Specifikke eksperimentelle design bør gennemføres ved at skræddersy til hvert projekt. Det anbefales, at man indeholder 3 til 5 retinale slag (fra samme øje eller samme mus) som tekniske replikerer og bruge prøver fra 3 eller flere mus som biologiske replikerer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde er støttet af Intramural Research Program af National Eye Institute (ZIAEY000450 og ZIAEY000546).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X PBS Thermo Fisher 14190-144
2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution Sigma D6134 Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time
30-gauge needle BD Precision Glide 305106
Antimycin A, 10 mM stock solution Sigma A8674 Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Bam15, 10 mM stock solution TimTec ST056388 Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Biopsy puncher, 1 mm Integra Miltex 33-31AA
Cell-Tak Corning Life Sciences CB40240
CO2 asphyxiation chamber
Dissection forceps-Dumont #5 Fine Science Tools 11251-10 Stright tip
Dissection forceps-Dumont #7 Fine Science Tools 11274-20 Curved tip
Dissection microscope
DMSO Sigma D2438
Graefe forceps Fine Science Tools 11051-10 Curved, Serrated tip
Microscissors Fine Science Tools 15004-08 Curved tip
NaOH solution, 1 M Sigma-Aldrich S8263 Aqueous solution, prepare ahead of time
Rotenone, 10 mM stock solution Sigma R8875 Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Seahorse calibration medium Agilent 100840-000
Seahorse XF 1.0 M glucose Agilent 103577-100
Seahorse XF 100 mM pyruvate Agilent 103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine Agilent 103579-100
Seahorse XF DMEM medium Agilent 103575-100 pH 7.4, with 5 mM HEPES
Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak Agilent 103518-100 Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate
Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer Agilent
Sodium bicarbonate solution, 0.1 M Sigma-Aldrich S5761 Aqueous solution, prepare ahead of time
Superfine eyelash brush Ted Pella 113

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
  2. Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye Brain. 2, 99-116 (2010).
  3. Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distribution and consumption within the retina in vascularised and avascular retinas and in animal models of retinal disease. Progress in Retina and Eye Research. 20, 175-208 (2001).
  4. Barot, M., Gokulgandhi, M. R., Mitra, A. K. Mitochondrial dysfunction in retinal diseases. Current Eye Research. 36 (12), 1069-1077 (2011).
  5. Joyal, J. S., Gantner, M. L., Smith, L. E. H. Retinal energy demands control vascular supply of the retina in development and disease: The role of neuronal lipid and glucose metabolism. Progress in Retina and Eye Research. 64, 131-156 (2018).
  6. Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas. Journal of Neuroscience Research. 93 (7), 1079-1092 (2015).
  7. Haydinger, C. D., Kittipassorn, T., Peet, D. J. Power to see-Drivers of aerobic glycolysis in the mammalian retina: A review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1057-1071 (2020).
  8. Wright, A. F., et al. Lifespan and mitochondrial control of neurodegeneration. Nature Genetics. 36, 1153-1158 (2004).
  9. Bossy-Wetzel, E., Schwarzenbacher, R., Lipton, S. A. Molecular pathways to neurodegeneration. Nature Medicine. 10, Suppl 2-9 (2004).
  10. Leveillard, T., Philp, N. J., Sennlaub, F. Is retinal metabolic dysfunction at the center of the pathogenesis of age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), (2019).
  11. Vlachantoni, D., et al. Evidence of severe mitochondrial oxidative stress and a protective effect of low oxygen in mouse models of inherited photoreceptor degeneration. Human Molecular Genetics. 20 (2), 322-335 (2011).
  12. Grenell, A., et al. Loss of MPC1 reprograms retinal metabolism to impair visual function. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (9), 3530-3535 (2019).
  13. Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews in Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).
  14. Jarrett, S. G., Boulton, M. E. Consequences of oxidative stress in age-related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 399-417 (2012).
  15. Rozing, M., et al. Age-related macular degeneration: A two-level model hypothesis. Progress in Retina Eye Research. 76, 100825 (2020).
  16. Yokosako, K., et al. Glycolysis in patients with age-related macular degeneration. Open Ophthalmology Journal. 8, 39-47 (2014).
  17. Bek, T. Mitochondrial dysfunction and diabetic retinopathy. Mitochondrion. 36, 4-6 (2017).
  18. Yumnamcha, T., Guerra, M., Singh, L. P., Ibrahim, A. S. Metabolic dysregulation and neurovascular dysfunction in diabetic retinopathy. Antioxidants. 9 (12), Basel. (2020).
  19. Futterman, S., Kinoshita, J. H. Metabolism of the retina. I. Respiration of cattle retina. Journal of Biological Chemistry. 234 (4), 723-726 (1959).
  20. Linsenmeier, R. A. Effects of light and darkness on oxygen distribution and consumption in the cat retina. Journal of General Physiology. 88 (4), 521-542 (1986).
  21. Medrano, C. J., Fox, D. A. Oxygen consumption in the rat outer and inner retina: light- and pharmacologically-induced inhibition. Experiments in Eye Research. 61 (3), 273-284 (1995).
  22. Kooragayala, K. Quantification of oxygen consumption in retina ex vivo demonstrates limited reserve capacity of photoreceptor mitochondria. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
  23. Adlakha, Y. K., Swaroop, A. Determination of mitochondrial oxygen consumption in the retina ex vivo: applications for retinal disease. Methods in Molecular Biology. 1753, 167-177 (2018).
  24. Agilent Mitocondrial stress test user guide. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Cell_Mito_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf (2021).
  25. Agilent Glycolytic rate assay user guide. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf (2021).
  26. Agilent wave 2.6 user guide. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/S7894-10000_Rev_C_Wave_2_6_User_Guide.pdf (2021).
  27. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. , Available from: https://www.avma.org/sites/default/files/2020-01/2020-Euthanasia-Final-1-17-20.pdf (2021).
  28. Improving Quantification of Cellular Glycolytic Rate Using Agilent Seahorse XF Technology. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/whitepaper/public/whitepaper-improve-quantification-of-cellular-glycolytic-rate-cell-analysis-5991-7894en-agilent.pdf (2021).
  29. Report Generator User Guide Agilent Seahorse XF Cell Mito Stress Test. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/Report_Generator_User_Guide_Seahorse_XF_Cell_Mito_Stress_Test_Single_File.pdf (2021).
  30. Agilent Seahorse XF Buffer Factor Protocol. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/usermanual-xf-buffer-factor-protocol-cell-analysis-S7888-10010en-agilent.pdf (2021).
  31. Agilent sensor cartridges and cell culture microplates. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991-8657EN_seahorse_plastics_brochure.pdf (2021).
  32. Agilent Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit User Guide. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf (2021).
  33. Fan, Y. Y. A bioassay to measure energy metabolism in mouse colonic crypts, organoids, and sorted stem cells. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309, 1-9 (2015).
  34. Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
  35. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  36. Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (10), 3890-3895 (2006).
  37. Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2014).
  38. Corso-Diaz, X., et al. Genome-wide profiling identifies DNA methylation signatures of aging in rod photoreceptors associated with alterations in energy metabolism. Cell Reports. 31 (3), 107525 (2020).
  39. Berkowitz, B. A., et al. Mitochondrial respiration in outer retina contributes to light-evoked increase in hydration in vivo. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (15), 5957-5964 (2018).
  40. Joyal, J. S., et al. Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1. Nature Medicine. 22 (4), 439-445 (2016).

Tags

Neurovidenskab udgave 174
Bestemmelse af mitokondrie respiration og glykolyse i <em>Ex Vivo</em> Retinal vævsprøver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiang, K., Nellissery, J., Swaroop,… More

Jiang, K., Nellissery, J., Swaroop, A. Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples. J. Vis. Exp. (174), e62914, doi:10.3791/62914 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter