Imagerie de l’absorption mitochondriale de Ca2+ dans les astrocytes et les neurones à l’aide d’indicateurs ca2+ codés génétiquement (GECI)

Summary

Ce protocole vise à fournir une méthode d’imagerie mitochondriale in vitro et in vivo du Ca²⁺ dans les astrocytes et les neurones.

Abstract

Le Ca²⁺ mitochondrial joue un rôle essentiel dans le contrôle de la mise en mémoire tampon cytosolique du Ca^2+, du métabolisme énergétique et de la transduction du signal cellulaire. La surcharge de Ca²⁺ mitochondrial contribue à diverses conditions pathologiques, y compris la neurodégénérescence et la mort cellulaire apoptotique dans les maladies neurologiques. Nous présentons ici une approche moléculaire spécifique au type cellulaire et ciblant les mitochondries pour l’imagerie mitochondriale Ca²⁺ dans les astrocytes et les neurones in vitro et in vivo. Nous avons construit des plasmides d’ADN codant pour des indicateurs Ca²⁺ (GECI) génétiquement codés ciblant les mitochondries GCaMP5G ou GCaMP6s (GCaMP5G/6s) avec des promoteurs spécifiques aux astrocytes et aux neurones gfaABC1D et CaMKII et une séquence de ciblage des mitochondries (mito-). Pour l’imagerie mitochondriale in vitro Ca^2+, les plasmides ont été transfectés dans des astrocytes et des neurones en culture pour exprimer GCaMP5G/6s. Pour l’imagerie mitochondriale in vivo Ca^2+, des vecteurs viraux adéno-associés (AAV) ont été préparés et injectés dans le cerveau des souris pour exprimer GCaMP5G/6s dans les mitochondries dans les astrocytes et les neurones. Notre approche fournit un moyen utile d’imager la dynamique mitochondriale du Ca²⁺ dans les astrocytes et les neurones afin d’étudier la relation entre la signalisation cytosolique et mitochondriale du Ca^{2+, ainsi} que les interactions astrocyte-neurone.

Introduction

Les mitochondries sont des organites subcellulaires dynamiques et sont considérées comme les centrales cellulaires pour la production d’énergie. D’autre part, les mitochondries peuvent absorber le Ca²⁺ dans la matrice en réponse à des augmentations locales ou cytosoliques de Ca^2+. L’absorption mitochondriale de Ca²⁺ affecte la fonction mitochondriale, y compris les processus métaboliques tels que les réactions dans le cycle de l’acide tricarboxylique (TCA) et la phosphorylation oxydative, et régule les protéines sensibles au Ca²⁺dans des conditions physiologiques^1,2,3,4. La surcharge mitochondriale de Ca²⁺ est également un déterminant de la mort cellulaire, y compris la nécrose et l’apoptose dans divers troubles cérébraux^5,6,7. Il provoque l’ouverture des pores de transition de perméabilité mitochondriale (PTMP) et la libération de cofacteur caspase, qui déclenchent la mort cellulaire apoptotique. Par conséquent, il est important d’étudier la dynamique et la manipulation du Ca²⁺ mitochondrial dans les cellules vivantes pour mieux comprendre la physiologie et la pathologie cellulaires.

Les mitochondries maintiennent l’homéostasie de la matrice Ca²⁺ grâce à un équilibre entre l’absorption et l’efflux de Ca^2+. L’absorption mitochondriale de Ca²⁺ est principalement médiée par les uniporteurs mitochondriaux de Ca²⁺ (MCU), tandis que l’efflux mitochondrial de Ca²⁺ est médié par les échangeurs Na⁺-Ca²⁺-Li⁺ (NCLX) et les échangeurs H⁺/ Ca^{2 +} (mHCX)⁸. L’équilibre peut être perturbé par la stimulation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG)⁹. L’homéostasie mitochondriale Ca²⁺ est également affectée par la mise en mémoire tampon mitochondriale par la formation de complexes xCa²⁺-xPO₄x-xOH insolubles⁸.

Les changements intracellulaires et mitochondriaux de la concentration de Ca²⁺ ([Ca²⁺]) peuvent être évalués par des indicateurs de Ca²⁺ fluorescents ou luminescents. La liaison du Ca²⁺ aux indicateurs provoque des modifications spectrales, permettant l’enregistrement de cellules libres [Ca^2+]en temps réel dans des cellules vivantes. Deux types de sondes sont actuellement disponibles pour surveiller les changements de Ca²⁺ dans les cellules : les indicateurs chimiques organiques et les indicateurs ca²⁺ (GECI) codés génétiquement. Généralement, différentes variantes avec différentes affinités Ca²⁺ (basées sur K_d),des propriétés spectrales (longueurs d’onde d’excitation et d’émission), des plages dynamiques et des sensibilités différentes sont disponibles pour les questions biologiques étudiées. Bien que de nombreux indicateurs de Ca²⁺ organiques synthétiques aient été utilisés pour l’imagerie cytosolique du Ca^2+, seuls quelques-uns peuvent être chargés sélectivement dans la matrice mitochondriale pour l’imagerie mitochondriale ca^2+, Rhod-2 étant le plus largement utilisé (pour les revues, voir^10,11). Cependant, Rhod-2 présente un inconvénient majeur de fuite lors d’expériences à long terme; en outre, il est divisé entre les mitochondries, d’autres organites et le cytosol, ce qui rend difficiles les mesures absolues dans différents sous-compartiments. En revanche, en utilisant des promoteurs spécifiques au type cellulaire et des séquences de ciblage des compartiments subcellulaires, les GECI peuvent être exprimés dans différents types de cellules et compartiments subcellulaires pour l’imagerie Ca²⁺ spécifique aux cellules et aux compartiments in vitro ou in vivo. Les indicateurs GCaMP Ca²⁺ basés sur l’intensité de fluorescence à longueur d’onde unique sont récemment apparus comme des GECI majeurs^12,13, 14^,15,16. Dans cet article, nous fournissons un protocole pour le ciblage des mitochondries et l’expression spécifique du type cellulaire de GCaMP5G et GCaMP6s (GCaMP5G/6s) dans les astrocytes et les neurones, et l’imagerie de l’absorption mitochondriale de Ca²⁺ dans ces types de cellules. En utilisant ce protocole, l’expression de GCaMP6G/6s dans les mitochondries individuelles peut être révélée, et l’absorption de Ca²⁺ en résolution mitochondriale unique peut être obtenue dans les astrocytes et les neurones in vitro et in vivo.

Protocol

Les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université du Missouri-Columbia. 1. Construction de plasmides d’ADN REMARQUE: Pour l’imagerie in vitro et in vivo, des plasmides d’ADN codant GCaMP5G / 6s avec des promoteurs spécifiques aux astrocytes et aux neurones et des séquences de ciblage mitochondrial sont construits. Insérer la…

Representative Results

L’objectif de cette étude était de fournir une méthodologie pour imager les signaux mitochondriaux Ca2+ en utilisant des GECI dans les astrocytes et les neurones in vitro et in vivo. Les résultats de l’imagerie mitochondriale in vitro et in vivo du Ca2+ sont présentés ici. Signalisation mitochondrialein vitro du Ca2+ dans les astrocytes et les neu…

Discussion

Dans cet article, nous fournissons une méthode et un protocole pour l’imagerie des signaux mitochondriaux Ca²⁺ dans les astrocytes et les neurones. Nous avons mis en œuvre des stratégies de ciblage des mitochondries et de type cellulaire spécifiques pour exprimer GECI GCaMP5G/6s. Pour cibler GCaMP5G/6s dans les mitochondries, nous avons inclus une séquence de ciblage des mitochondries dans les plasmides. Pour exprimer GCaMP5G/6s dans les astrocytes et les neurones in vivo,nous avons inséré un…

Materials

Artificial tears ointment	Rugby	NDC-0536-6550-91	83% white petrolatum
Cyanoacrylate glue	World Precision Instruments		3M Vetbond Adhesive
Dissecting stereomicroscope	Nikon	SMZ 2B	Surgery
Dumont forceps with fine tip	Fine Science Tools	11255-20	for removal of dura
Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick	Fisher Scientific	12-542A	for cranial window cover
High speed micro drill	Fine Science Tools	18000-17	with bone polishing drill bit
Injection syringe	Hamilton	2.5 ml	for viral injection
Ketamine	VEDCO	NDC-50989-996-06	100 mg/kg body weight
Low melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9793	reducing movement artifacts
Metal frame	Custom-made	see Fig 1	for brain attachment to microscope stage
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	UMP3	Injection speed controller
Mouse stereotaxic device	Stoelting	51725	for holding mice
Perfusion chamber	Warner Instruments	64-0284
Persfusion system	ALA Scientific Instruments	ALA-VM8
Self-regulating heating pad	Fine Science Tools	21061	to prevent hypothermia of mice
Sulforhodamine 101	Invitrogen	S-359	red fluorescent dye to label astrocytes
Surgical scissors, 12 cm	Fine Science Tools	14002-12	for dissection
Trephine	Fine Science Tools	18004-23	for clearing of material
Xylazine	VEDCO	NDC-50989-234-11	10 mg/kg body weight