Obtención de imágenes de ca2+ mitocondrial en astrocitos y neuronas utilizando indicadores de Ca2+ codificados genéticamente (GECI)

Summary

Este proctocol tiene como objetivo proporcionar un método para imágenes de Ca²⁺ mitocondrial in vitro e in vivo en astrocitos y neuronas.

Abstract

El Ca²⁺ mitocondrial desempeña un papel fundamental en el control de la amortiguación citosólica del Ca^2+, el metabolismo energético y la transducción de señales celulares. La sobrecarga de Ca²⁺ mitocondrial contribuye a diversas afecciones patológicas, incluida la neurodegeneración y la muerte celular apoptótica en enfermedades neurológicas. Aquí presentamos un enfoque molecular específico de tipo celular y dirigido a mitocondrias para imágenes mitocondriales de Ca²⁺ en astrocitos y neuronas in vitro e in vivo. Construimos plásmidos de ADN que codifican indicadores de Ca²⁺ codificados genéticamente (GECI) GCaMP5G o GCaMP6s (GCaMP5G/6s) dirigidos a mitocondrias con promotores específicos de astrocitos y neuronas gfaABC1D y CaMKII y secuencia dirigida a mitocondrias (mito-). Para las imágenes mitocondriales in vitro de Ca^2+, los plásmidos se transfectaron en astrocitos y neuronas cultivados para expresar GCaMP5G/6s. Para las imágenes mitocondriales in vivo de Ca^2+, se prepararon vectores virales adenoasociados (AVA) e inyectaron en los cerebros de los ratones para expresar GCaMP5G/6s en mitocondrias en astrocitos y neuronas. Nuestro enfoque proporciona un medio útil para obtener imágenes de la dinámica mitocondrial de Ca^{2 +} en astrocitos y neuronas para estudiar la relación entre la señalización citosólica y mitocondrial de Ca^{2 +,} así como las interacciones astrocito-neurona.

Introduction

Las mitocondrias son orgánulos subcelulares dinámicos y se consideran como las centrales eléctricas celulares para la producción de energía. Por otro lado, las mitocondrias pueden absorber Ca²⁺ a la matriz en respuesta a las elevaciones locales o citosólicas de Ca^2+. La absorción mitocondrial de Ca²⁺ afecta la función mitocondrial, incluidos los procesos metabólicos como las reacciones en el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) y la fosforilación oxidativa, y regula las proteínas sensibles al Ca²⁺en condiciones fisiológicas^1,2,3,4. La sobrecarga mitocondrial de Ca²⁺ también es un determinante para la muerte celular, incluyendo necrosis y apoptosis en diversos trastornos cerebrales^5,6,7. Provoca la apertura de los poros de transición de permeabilidad mitocondrial (mPTPs) y la liberación del cofactor caspasa, que inician la muerte celular apoptótica. Por lo tanto, es importante estudiar la dinámica y el manejo del Ca²⁺ mitocondrial en las células vivas para comprender mejor la fisiología y la patología celular.

Las mitocondrias mantienen la homeostasis de Ca²⁺ de la matriz a través de un equilibrio entre la absorción de Ca²⁺ y el eflujo. La absorción mitocondrial de Ca²⁺ está mediada principalmente por uniportadores mitocondriales de Ca²⁺ (MCU), mientras que el eflujo mitocondrial de Ca²⁺ está mediado por los intercambiadores Na⁺-Ca²⁺-Li⁺ (NCLX) y los intercambiadores H⁺/ Ca^{2 +} (mHCX)⁸. El equilibrio puede ser perturbado a través de la estimulación de los receptores acoplados a proteínas G (GPCR)⁹. La homeostasis mitocondrial de Ca²⁺ también se ve afectada por la amortiguación mitocondrial por la formación de complejos insolubles xCa²⁺-xPO₄x-xOH⁸.

Los cambios intracelulares y mitocondriales en la concentración de Ca²⁺ ([Ca²⁺]) pueden evaluarse mediante indicadores fluorescentes o luminiscentes de Ca^2+. La unión de Ca²⁺ a los indicadores provoca modificaciones espectrales, lo que permite el registro de células libres [Ca^2+]en tiempo real en células vivas. Actualmente hay dos tipos de sondas disponibles para monitorear los cambios de Ca²⁺ en las células: indicadores químicos orgánicos e indicadores de Ca²⁺ codificados genéticamente (GECI). En general, diferentes variantes con diferentes afinidades de Ca²⁺ (basadas en K_d),propiedades espectrales (longitudes de onda de excitación y emisión), rangos dinámicos y sensibilidades están disponibles para las preguntas biológicas bajo investigación. Aunque se han utilizado muchos indicadores sintéticos orgánicos de Ca²⁺ para imágenes de Ca²⁺ citosólico, solo unos pocos pueden cargarse selectivamente en la matriz mitocondrial para imágenes mitocondriales de Ca^2+, siendo Rhod-2 el más utilizado (para revisiones ver^10,11). Sin embargo, Rhod-2 tiene un gran inconveniente de fuga durante los experimentos de largo plazo; además, se divide entre mitocondrias, otros orgánulos y el citosol, dificultando las mediciones absolutas en diferentes subcompartimentos. Por el contrario, mediante el uso de promotores específicos de tipo celular y secuencias de orientación de compartimentos subcelulares, los GECI se pueden expresar en diferentes tipos de células y compartimentos subcelulares para imágenes de Ca²⁺ específicas de células y compartimentos in vitro o in vivo. Los indicadores GCaMP Ca²⁺ basados en la intensidad de fluorescencia de longitud de onda única han surgido recientemente como los principales GECI^{12,13,14,15,16.} En este artículo, proporcionamos un protocolo para la orientación de las mitocondrias y la expresión específica del tipo celular de GCaMP5G y GCaMP6s (GCaMP5G / 6s) en astrocitos y neuronas, y la obtención de imágenes de la absorción mitocondrial de Ca^{2 +} en estos tipos de células. Usando este protocolo, se puede revelar la expresión de GCaMP6G/6s en mitocondrias individuales, y se puede lograr la absorción de Ca²⁺ en resolución mitocondrial única en astrocitos y neuronas in vitro e in vivo.

Protocol

Los procedimientos que involucran animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Missouri-Columbia. 1. Construcción de plásmidos de ADN NOTA: Para imágenes in vitro e in vivo, se construyen plásmidos de ADN que codifican GCaMP5G/6s con promotores específicos de astrocitos y neuronas y secuencias de orientación mitocondrial. Insertar la secuencia dir…

Representative Results

El objetivo de este estudio fue proporcionar una metodología para obtener imágenes de señales mitocondriales de Ca2+ utilizando GECI en astrocitos y neuronas in vitro e in vivo. Aquí se presentan los resultados de las imágenes mitocondriales de Ca2+ in vitro e in vivo. Señalización in vitro mitocondrial de Ca2+ en astrocitos y neuronas cultivadas</st…

Discussion

En este artículo, proporcionamos un método y protocolo para obtener imágenes de señales mitocondriales de Ca^{2 +} en astrocitos y neuronas. Implementamos estrategias específicas de mitocondrias y tipo de célula para expresar GECI GCaMP5G/6s. Para dirigirnos a GCaMP5G/6s en mitocondrias, incluimos una secuencia dirigida a mitocondrias en los plásmidos. Para expresar GCaMP5G/6s en astrocitos y neuronas in vivo,insertamos un promotor específico de astrocitos gfaABC1D y un promotor específico de ne…

Materials

Artificial tears ointment	Rugby	NDC-0536-6550-91	83% white petrolatum
Cyanoacrylate glue	World Precision Instruments		3M Vetbond Adhesive
Dissecting stereomicroscope	Nikon	SMZ 2B	Surgery
Dumont forceps with fine tip	Fine Science Tools	11255-20	for removal of dura
Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick	Fisher Scientific	12-542A	for cranial window cover
High speed micro drill	Fine Science Tools	18000-17	with bone polishing drill bit
Injection syringe	Hamilton	2.5 ml	for viral injection
Ketamine	VEDCO	NDC-50989-996-06	100 mg/kg body weight
Low melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9793	reducing movement artifacts
Metal frame	Custom-made	see Fig 1	for brain attachment to microscope stage
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	UMP3	Injection speed controller
Mouse stereotaxic device	Stoelting	51725	for holding mice
Perfusion chamber	Warner Instruments	64-0284
Persfusion system	ALA Scientific Instruments	ALA-VM8
Self-regulating heating pad	Fine Science Tools	21061	to prevent hypothermia of mice
Sulforhodamine 101	Invitrogen	S-359	red fluorescent dye to label astrocytes
Surgical scissors, 12 cm	Fine Science Tools	14002-12	for dissection
Trephine	Fine Science Tools	18004-23	for clearing of material
Xylazine	VEDCO	NDC-50989-234-11	10 mg/kg body weight