يتم تحديد الاستخدام المشترك لتكنولوجيا مصفوفة microelectrode والتحفيز الكيميائي الناجم عن 4-aminopyridine للتحقيق في نشاط مسبب للألم على مستوى الشبكة في القرن الظهري للحبل الشوكي.
يتم تحديد أدوار واتصال أنواع محددة من الخلايا العصبية داخل القرن الظهري للحبل الشوكي (DH) بمعدل سريع لتوفير رؤية مفصلة بشكل متزايد للدوائر التي تقوم عليها معالجة آلام العمود الفقري. ومع ذلك ، فإن آثار هذه الاتصالات على نشاط الشبكة الأوسع في DH لا تزال أقل فهما لأن معظم الدراسات تركز على نشاط الخلايا العصبية المفردة والدوائر الدقيقة الصغيرة. بدلا من ذلك ، فإن استخدام صفائف الأقطاب الكهربائية الدقيقة (MEAs) ، والتي يمكنها مراقبة النشاط الكهربائي عبر العديد من الخلايا ، يوفر دقة مكانية وزمنية عالية للنشاط العصبي. هنا ، يتم وصف استخدام MEAs مع شرائح الحبل الشوكي للفئران لدراسة نشاط DH الناجم عن دوائر DH المحفزة كيميائيا باستخدام 4-aminopyridine (4-AP). يقتصر النشاط الإيقاعي الناتج على DH السطحي ، المستقر بمرور الوقت ، المحظور بواسطة tetrodotoxin ، ويمكن التحقيق فيه في اتجاهات شريحة مختلفة. معا ، يوفر هذا المستحضر منصة للتحقيق في نشاط دائرة DH في الأنسجة من الحيوانات الساذجة ، والنماذج الحيوانية للألم المزمن ، والفئران ذات وظيفة مسببة للألم معدلة وراثيا. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام تسجيلات MEA في شرائح الحبل الشوكي المحفزة بتقنية 4-AP كأداة فحص سريع لتقييم قدرة المركبات الجديدة المضادة للحساسية على تعطيل النشاط في DH الحبل الشوكي.
يتم الكشف عن أدوار أنواع محددة من الخلايا العصبية المثبطة والمثيرة داخل الحبل الشوكي DH بمعدل سريع1،2،3،4. معا ، تشكل الخلايا العصبية الداخلية أكثر من 95٪ من الخلايا العصبية في DH وتشارك في المعالجة الحسية ، بما في ذلك nociception. علاوة على ذلك ، فإن هذه الدوائر بين الخلايا العصبية مهمة لتحديد ما إذا كانت الإشارات الطرفية تصعد إلى المحور العصبي للوصول إلى الدماغ والمساهمة في إدراك الألم5،6،7. حتى الآن ، حققت معظم الدراسات في دور الخلايا العصبية DH على مستوى التحليل إما على مستوى الخلية الواحدة أو الكائن الحي بأكمله باستخدام مجموعات من الفيزيولوجيا الكهربية داخل الخلايا في المختبر ، ووضع العلامات التشريحية العصبية ، والتحليل السلوكي في الجسم الحي 1،3،8،9،10،11،12،13،14 . وقد عززت هذه الأساليب بشكل كبير في فهم دور مجموعات محددة من الخلايا العصبية في معالجة الألم. ومع ذلك ، لا تزال هناك فجوة في فهم كيفية تأثير أنواع معينة من الخلايا والدوائر الكلية الصغيرة على مجموعات كبيرة من الخلايا العصبية على مستوى الدائرة الدقيقة لتشكيل مخرجات DH والاستجابات السلوكية وتجربة الألم.
إحدى التقنيات التي يمكنها التحقيق في الدائرة الكلية أو وظيفة المستوى متعدد الخلايا هي مصفوفة القطب الدقيق (MEA) 15,16. تم استخدام MEAs للتحقيق في وظيفة الجهاز العصبي لعدة عقود17,18. في الدماغ ، قاموا بتسهيل دراسة تطور الخلايا العصبية ، واللدونة المشبكية ، والفحص الدوائي ، واختبار السمية17،18. يمكن استخدامها لكل من التطبيقات في المختبر وفي الجسم الحي ، اعتمادا على نوع MEA. وعلاوة على ذلك، تطور تطوير الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف بسرعة، حيث أصبحت أعداد الأقطاب الكهربائية المختلفة وتكويناتها متاحة الآن19. تتمثل إحدى المزايا الرئيسية ل MEAs في قدرتها على تقييم النشاط الكهربائي في العديد من الخلايا العصبية في وقت واحد بدقة مكانية وزمنية عالية عبر أقطاب كهربائية متعددة15,16. وهذا يوفر قراءة أوسع لكيفية تفاعل الخلايا العصبية في الدوائر والشبكات، في ظل ظروف التحكم وفي وجود المركبات المطبقة محليا.
أحد التحديات التي تواجه الاستعدادات في المختبر DH هو أن مستويات النشاط المستمرة عادة ما تكون منخفضة. هنا ، يتم التعامل مع هذا التحدي في دوائر DH للحبل الشوكي باستخدام مانع قناة K + ذو بوابات الجهد ، 4-aminopryidine (4-AP) ، لتحفيز دوائر DH كيميائيا. وقد استخدم هذا الدواء سابقا لإنشاء نشاط كهربائي متزامن إيقاعي في DH من شرائح الحبل الشوكي الحادة وتحت الظروف الحادة في الجسم الحي 20،21،22،23،24. استخدمت هذه التجارب رقعة أحادية الخلية وتسجيلا خارج الخلية أو تصويرا بالكالسيوم لتوصيف النشاط الناجم عن 4-AP 20,21,22,23,24,25. معا ، أظهر هذا العمل متطلبات النقل المشبكي المثير والمثبط والمشابك الكهربائية للنشاط الإيقاعي الناجم عن 4-AP. وبالتالي ، فقد تم النظر إلى استجابة 4-AP على أنها نهج يكشف النقاب عن دوائر DH متعددة التشابك الأصلية ذات الصلة البيولوجية بدلا من كونها ظاهرة عرضية ناجمة عن المخدرات. علاوة على ذلك ، يظهر النشاط الناجم عن 4-AP ملف استجابة مشابها للأدوية المسكنة والمضادة للصرع كحالات ألم الأعصاب وقد تم استخدامه لاقتراح أهداف جديدة للعقاقير المسكنة القائمة على العمود الفقري مثل connexins20,21,22.
هنا ، يتم وصف إعداد يجمع بين MEAs والتنشيط الكيميائي ل DH الشوكي مع 4-AP لدراسة هذه الدوائر المسببة للألم على مستوى الدائرة الكلية ، أو مستوى الشبكة من التحليل. يوفر هذا النهج منصة مستقرة وقابلة للتكرار للتحقيق في الدوائر المسببة للألم في ظل ظروف “تشبه الألم” الساذجة والاعتلال العصبي. هذا التحضير قابل للتطبيق بسهولة لاختبار عمل المسكنات المعروفة على مستوى الدائرة وفحص المسكنات الجديدة في الحبل الشوكي مفرط النشاط.
على الرغم من أهمية DH الشوكي في الإشارات المسببة للألم والمعالجة والاستجابات السلوكية والعاطفية الناتجة التي تميز الألم ، إلا أن الدوائر داخل هذه المنطقة لا تزال غير مفهومة بشكل جيد. كان التحدي الرئيسي في التحقيق في هذه المشكلة هو تنوع مجموعات الخلايا العصبية التي تشكل هذه الدوائر<sup class="xr…
The authors have nothing to disclose.
تم تمويل هذا العمل من قبل المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (NHMRC) في أستراليا (منح 631000 ، 1043933 ، 1144638 ، 1184974 إلى B.A.G. و R.J.C.) ومعهد هنتر للبحوث الطبية (منحة إلى B.A.G. و R.J.C.).
4-aminopyridine | Sigma-Aldrich | 275875-5G | |
100% ethanol | Thermo Fisher | AJA214-2.5LPL | |
CaCl2 1M | Banksia Scientific | 0430/1L | |
Carbonox (Carbogen – 95% O2, 5% CO2) | Coregas | 219122 | |
Curved long handle spring scissors | Fine Science Tools | 15015-11 | |
Custom made air interface incubation chamber | |||
Foetal bovine serum | Thermo Fisher | 10091130 | |
Forceps Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
Glucose | Thermo Fisher | AJA783-500G | |
Horse serum | Thermo Fisher | 16050130 | |
Inverted microscope | Zeiss | Axiovert10 | |
KCl | Thermo Fisher | AJA383-500G | |
Ketamine | Ceva | KETALAB04 | |
Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14007-14 | |
Loctite 454 Instant Adhesive | Bolts and Industrial Supplies | L4543G | |
MATLAB | MathWorks | R2018b | |
MEAs, 3-Dimensional | Multichannel Systems | 60-3DMEA100/12/40iR-Ti, 60-3DMEA200/12/50iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in an 8×8 square grid. Electrodes are 12 µm in diameter, 40 µm (100/12/40) or 50 µm (200/12/50) high and equidistantly spaced 100 µm (100/12/40) or 200 µm (200/12/50) apart. |
MEA headstage | Multichannel Systems | MEA2100-HS60 | |
MEA interface board | Multichannel Systems | MCS-IFB 3.0 Multiboot | |
MEA net | Multichannel Systems | ALA HSG-MEA-5BD | |
MEA perfusion system | Multichannel Systems | PPS2 | |
MEAs, Planar | Multichannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti, 60MEA500/30iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in either a 8×8 square grid (200/30) or a 6×10 rectangular grid (500/30). Electrodes are 30 µm in diameter and equidistantly spaced 200 µm (200/30) or 500 µm (500/30) apart. |
MgCl2 | Thermo Fisher | AJA296-500G | |
Microscope camera | Motic | Moticam X Wi-Fi | |
Multi Channel Analyser software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
Multi Channel Experimenter software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
NaCl | Thermo Fisher | AJA465-500G | |
NaHCO3 | Thermo Fisher | AJA475-500G | |
NaH2PO4 | Thermo Fisher | ACR207805000 | |
Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | |
Small spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
Small surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Sucrose | Thermo Fisher | AJA530-500G | |
Superglue | cyanoacrylate adhesive | ||
Tetrodotoxin | Abcam | AB120055 | |
Vibration isolation table | Newport | VH3048W-OPT | |
Vibrating microtome | Leica | VT1200 S |