Registro de la actividad de la red en circuitos nociceptivos espinales utilizando matrices de microelectrodos
Summary
Se describe el uso combinado de la tecnología de matriz de microelectrodos y la estimulación química inducida por 4-aminopiridina para investigar la actividad nociceptiva a nivel de red en el asta dorsal de la médula espinal.
Abstract
Los roles y la conectividad de tipos específicos de neuronas dentro del asta dorsal de la médula espinal (DH) se están delineando a un ritmo rápido para proporcionar una visión cada vez más detallada de los circuitos que sustentan el procesamiento del dolor espinal. Sin embargo, los efectos de estas conexiones para una actividad de red más amplia en la DH siguen siendo menos conocidos porque la mayoría de los estudios se centran en la actividad de neuronas individuales y microcircuitos pequeños. Alternativamente, el uso de matrices de microelectrodos (AMUMA), que pueden monitorear la actividad eléctrica en muchas células, proporciona una alta resolución espacial y temporal de la actividad neuronal. Aquí, se describe el uso de AMUMA con cortes de médula espinal de ratón para estudiar la actividad de DH inducida por circuitos de DH químicamente estimulantes con 4-aminopiridina (4-AP). La actividad rítmica resultante está restringida a la DH superficial, estable en el tiempo, bloqueada por tetrodotoxina, y puede ser investigada en diferentes orientaciones de corte. Juntos, esta preparación proporciona una plataforma para investigar la actividad del circuito DH en tejidos de animales ingenuos, modelos animales de dolor crónico y ratones con función nociceptiva genéticamente alterada. Además, los registros de MEA en cortes de médula espinal estimulados con 4-AP se pueden utilizar como una herramienta de detección rápida para evaluar la capacidad de los nuevos compuestos antinociceptivos para interrumpir la actividad en la DH de la médula espinal.
Introduction
Las funciones de tipos específicos de interneuronas inhibitorias y excitatorias dentro de la DH de la médula espinal se están descubriendo a un ritmo rápido 1,2,3,4. Juntas, las interneuronas constituyen más del 95% de las neuronas en la DH y están involucradas en el procesamiento sensorial, incluida la nocicepción. Además, estos circuitos interneuronales son importantes para determinar si las señales periféricas ascienden al neuroeje para llegar al cerebro y contribuyen a la percepción del dolor 5,6,7. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios han investigado el papel de las neuronas DH a nivel de análisis de una sola célula o de todo el organismo utilizando combinaciones de electrofisiología intracelular in vitro, etiquetado neuroanatómico y análisis conductual in vivo 1,3,8,9,10,11,12,13,14 . Estos enfoques han avanzado significativamente en la comprensión del papel de poblaciones específicas de neuronas en el procesamiento del dolor. Sin embargo, sigue habiendo una brecha en la comprensión de cómo los tipos específicos de células y los pequeños macrocircuitos influyen en grandes poblaciones de neuronas a nivel de microcircuito para posteriormente dar forma a la salida de la DH, las respuestas conductuales y la experiencia del dolor.
Una tecnología que puede investigar la función de macrocircuito o multicelular es la matriz de microelectrodos (MEA)15,16. Los AMUMA se han utilizado para investigar la función del sistema nervioso durante varias décadas17,18. En el cerebro, han facilitado el estudio del desarrollo neuronal, la plasticidad sináptica, el cribado farmacológico y las pruebas de toxicidad17,18. Se pueden utilizar tanto para aplicaciones in vitro como in vivo, dependiendo del tipo de MEA. Además, el desarrollo de los AMUMA ha evolucionado rápidamente, con diferentes números de electrodos y configuraciones ahora disponibles19. Una ventaja clave de los AMUMA es su capacidad para evaluar simultáneamente la actividad eléctrica en muchas neuronas con alta precisión espacial y temporal a través de múltiples electrodos15,16. Esto proporciona una lectura más amplia de cómo las neuronas interactúan en circuitos y redes, en condiciones de control y en presencia de compuestos aplicados localmente.
Un desafío de las preparaciones de DH in vitro es que los niveles de actividad en curso suelen ser bajos. Aquí, este desafío se aborda en los circuitos dh de la médula espinal utilizando el bloqueador de canales K + dependiente de voltaje, 4-aminopryidine (4-AP), para estimular químicamente los circuitos DH. Este fármaco se ha utilizado previamente para establecer la actividad eléctrica síncrona rítmica en la DH de cortes agudos de la médula espinal y en condiciones agudas in vivo 20,21,22,23,24. Estos experimentos han utilizado parches unicelulares y registro extracelular o imágenes de calcio para caracterizar la actividad inducida por 4-AP 20,21,22,23,24,25. En conjunto, este trabajo ha demostrado el requisito de transmisión sináptica excitatoria e inhibitoria y sinapsis eléctricas para la actividad rítmica inducida por 4-AP. Por lo tanto, la respuesta 4-AP se ha visto como un enfoque que desenmascara los circuitos polisinápticos nativos de DH con relevancia biológica en lugar de como un epifenómeno inducido por fármacos. Además, la actividad inducida por 4-AP exhibe un perfil de respuesta similar a los fármacos analgésicos y antiepilépticos como las condiciones de dolor neuropático y se ha utilizado para proponer nuevas dianas farmacológicas analgésicas basadas en la columna vertebral como las conexinas 20,21,22.
Aquí, se describe una preparación que combina MEA y activación química de la DH espinal con 4-AP para estudiar este circuito nociceptivo en el macrocircuito, o nivel de análisis de red. Este enfoque proporciona una plataforma estable y reproducible para investigar circuitos nociceptivos en condiciones ingenuas y neuropáticas “similares al dolor”. Esta preparación también es fácilmente aplicable para probar la acción a nivel de circuito de analgésicos conocidos y para detectar analgésicos novedosos en la médula espinal hiperactiva.
Protocol
Representative Results
Discussion
A pesar de la importancia de la DH espinal en la señalización nociceptiva, el procesamiento y las respuestas conductuales y emocionales resultantes que caracterizan el dolor, los circuitos dentro de esta región siguen siendo poco conocidos. Un desafío clave en la investigación de este tema ha sido la diversidad de poblaciones de neuronas que comprenden estos circuitos 6,31,32. Los recientes avances en tecnologí…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica (NHMRC) de Australia (subvenciones 631000, 1043933, 1144638 y 1184974 a B.A.G. y R.J.C.) y el Instituto de Investigación Médica Hunter (subvención a B.A.G. y R.J.C.).
Materials
| 4-aminopyridine | Sigma-Aldrich | 275875-5G | |
| 100% ethanol | Thermo Fisher | AJA214-2.5LPL | |
| CaCl2 1M | Banksia Scientific | 0430/1L | |
| Carbonox (Carbogen – 95% O2, 5% CO2) | Coregas | 219122 | |
| Curved long handle spring scissors | Fine Science Tools | 15015-11 | |
| Custom made air interface incubation chamber | |||
| Foetal bovine serum | Thermo Fisher | 10091130 | |
| Forceps Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Glucose | Thermo Fisher | AJA783-500G | |
| Horse serum | Thermo Fisher | 16050130 | |
| Inverted microscope | Zeiss | Axiovert10 | |
| KCl | Thermo Fisher | AJA383-500G | |
| Ketamine | Ceva | KETALAB04 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14007-14 | |
| Loctite 454 Instant Adhesive | Bolts and Industrial Supplies | L4543G | |
| MATLAB | MathWorks | R2018b | |
| MEAs, 3-Dimensional | Multichannel Systems | 60-3DMEA100/12/40iR-Ti, 60-3DMEA200/12/50iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in an 8×8 square grid. Electrodes are 12 µm in diameter, 40 µm (100/12/40) or 50 µm (200/12/50) high and equidistantly spaced 100 µm (100/12/40) or 200 µm (200/12/50) apart. |
| MEA headstage | Multichannel Systems | MEA2100-HS60 | |
| MEA interface board | Multichannel Systems | MCS-IFB 3.0 Multiboot | |
| MEA net | Multichannel Systems | ALA HSG-MEA-5BD | |
| MEA perfusion system | Multichannel Systems | PPS2 | |
| MEAs, Planar | Multichannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti, 60MEA500/30iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in either a 8×8 square grid (200/30) or a 6×10 rectangular grid (500/30). Electrodes are 30 µm in diameter and equidistantly spaced 200 µm (200/30) or 500 µm (500/30) apart. |
| MgCl2 | Thermo Fisher | AJA296-500G | |
| Microscope camera | Motic | Moticam X Wi-Fi | |
| Multi Channel Analyser software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
| Multi Channel Experimenter software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
| NaCl | Thermo Fisher | AJA465-500G | |
| NaHCO3 | Thermo Fisher | AJA475-500G | |
| NaH2PO4 | Thermo Fisher | ACR207805000 | |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Small spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Sucrose | Thermo Fisher | AJA530-500G | |
| Superglue | cyanoacrylate adhesive | ||
| Tetrodotoxin | Abcam | AB120055 | |
| Vibration isolation table | Newport | VH3048W-OPT | |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 S |
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