ספיגת הגלוקוז מוגברת בתאי העצב המוטוריים של Drosophila המושפעים מחלבון מחייב DNA TAR (TDP-43), כפי שצוין על ידי חיישן גלוקוז מבוסס FRET, מקודד גנטית.
טרשת אמיוטרופית לרוחב היא הפרעה ניווניות הגורמת לחולשת שרירים מתקדמת ומוות בתוך 2-5 שנים לאחר האבחון. ביטויים קליניים כוללים ירידה במשקל, דיסליפידמיה, היפרמטבוליזם; עם זאת, עדיין לא ברור כיצד אלה מתייחסים ניוון נוירון מוטורי. באמצעות מודל Drosophila של חלבון TDP-43 כי recapitulates מספר תכונות של ALS כולל תכלילים ציטופלסמיים, תפקוד לקוי locomotor, ותוחלת חיים מופחתת, לאחרונה זיהינו ליקויים מטבוליים רחבים. בין אלה, גליקוליזה נמצאה upregulated וניסויי אינטראקציה גנטית סיפקו ראיות למנגנון neuroprotective מפצה. ואכן, למרות upregulation של phosphofructokinase, קצב הגבלת האנזים בגליקוליזיס, עלייה בגליקוליזיס באמצעות מניפולציות תזונתיות וגנטיות הוכח כדי להקל על תפקוד לקוי locomotor ותוחלת חיים מוגברת במודלים זבובים של חלבון TDP-43. כדי לחקור עוד יותר את ההשפעה על חלבון TDP-43 על שטף גליקוליטי בתאי עצב מוטוריים, דווח בעבר מקודד גנטית, חיישן מבוסס FRET, FLII12Pglu-700μδ6, שימש. חיישן זה מורכב מתחום חישת גלוקוז חיידקי וחלבונים פלואורסצנטיים ציאן וצהוב כצמד FRET. לאחר כריכת גלוקוז, החיישן עובר שינוי קונפורמציה המאפשר FRET להתרחש. באמצעות FLII12Pglu-700μδ6, ספיגת גלוקוז נמצאה עלייה משמעותית נוירונים מוטוריים המבטאים TDP-43G298S, גרסה הגורמת ALS. כאן, אנו מראים כיצד למדוד ספיגת גלוקוז, ex vivo, בתכשירי כבל עצב גחון זחל מבטא את חיישן גלוקוז FLII12Pglu-700μδ6 בהקשר של חלבון TDP-43. גישה זו יכולה לשמש כדי למדוד את ספיגת הגלוקוז ולהעריך שטף גליקוליטי בסוגי תאים שונים או בהקשר של מוטציות שונות הגורמות ALS והפרעות ניווניות הקשורות.
טרשת אמיוטרופית לרוחב (ALS) היא הפרעה נוירודגנרטיבית מתקדמת כי הוא כרגע חשוכת מרפא. ALS משפיע על נוירונים מוטוריים עליונים ותחתונים המובילים לאובדן קואורדינציה מוטורית, שיתוק בלתי הפיך, כשל נשימתי, ומוות בסופו של דבר בתוך 2-5 שנים שלאבחון 1. ALS קשורה פגמים מטבוליים כגון ירידה במשקל, דיסליפידמיה, היפרמטבוליזם (נבדק ב2); עם זאת, עדיין לא ברור כיצד שינויים אלה בחילוף החומרים מתייחסים ניוון נוירון מוטורי. מכנה נפוץ ב- ALS ומחלות ניווניות הקשורות הוא TDP-43, חלבון מחייב חומצת גרעין המעורב במספר שלבים של עיבוד RNA3,4,5. למרות מוטציות ב TDP-43 משפיעות רק על 3%-5% מהחולים, חלבון מסוג TDP-43 מסוג בר נמצא בתוך אגרגטים ציטופלסמיים >97% ממקרי ALS (נבדק ב-6). פתולוגיה זו עוצבה בדרוסופילה על ידי ביטוי יתר של סוג בר אנושי או מוטציה TDP-43 (G298S) בתאי עצב מוטוריים, אשר משחזר היבטים מרובים של ALS, כולל הכללות ציטופלסמיות, תפקוד לקוי של לוקומוטור ותוחלת חיים מופחתת7,8. באמצעות מודלים אלה, דווח לאחרונה כי חלבון TDP-43 גורם לעלייה משמעותית ברמות הפירובאט וה-phosphofructokinase (PFK) mRNA, האנזים המגביל את קצב הגליקוליזיס9. עליות דומות בתמלילים PFK נמצאו נוירונים מוטוריים שמקורם בחולה וחוט השדרה, דבר המצביע על כך גליקוליזה הוא upregulated בהקשר של חלבון TDP-43. מעניין, עלייה נוספת בגליקוליזה באמצעות מניפולציות תזונתיות וגנטיות הקלה על מספר פנוטיפים של ALS כגון תפקוד לקוי של לוקומוטור ותוחלת חיים מוגברת במודלים של פרוטאינופתיה TDP-43, עולה בקנה אחד עם מנגנון מפצה, neuroprotective נוירונים מוטוריים מתנוונים.
כדי לחקור שינויים נוספים בגליקוליזיס ולמדוד את ספיגת הגלוקוז במודלים Drosophila של חלבון TDP-43, חיישן מבוסס FRET שדווח בעבר מקודד גנטית FLII12Pglu-700μδ610 בא לידי ביטוי נוירונים מוטוריים במיוחד באמצעות מערכת הביטוי UAS-GAL4. חיישן הגלוקוז FLII12Pglu-700μδ6 משתמש בהעברת אנרגיית תהודה בין שתי גרסאות של חלבון פלואורסצנטי ירוק, ציאני וחלבוני פלורסנט צהובים (CFP ו- YFP) כדי לזהות גלוקוז ברמה התאית. הוא מורכב מתחום מחייב גלוקוז חיידקי מהגן E. coli MglB התמזג CFP ו YFP בקצוות מנוגדים של המולקולה. כאשר הוא קשור למולקולת גלוקוז, החיישן עובר שינוי קונפורמציה המקרב את CFP ו- YFP זה לזה ומאפשר ל- FRET להתרחש, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בו כדי לכמת את רמות הגלוקוז התאי10,11,12 ( איור1). כאן, אנו מראים כיצד חיישן FLII12Pglu-700μδ6 יכול לשמש כדי לקבוע שינויים בספיגת הגלוקוז הנגרמים על ידי חלבון TDP-43 בתאי עצב מוטוריים. הניסויים המתוארים כאן מראים כי ביטוי יתר של מוטציה הקשורה ALS, TDP-43G298S, בתאי עצב מוטוריים גורם לעלייה משמעותית בספיגת הגלוקוז בהשוואה לבקרות. גישה זו יכולה לשמש בסוגים אחרים של ALS (למשל, SOD1, C9orf72 וכו ‘) ו/או סוגי תאים אחרים (למשל, גליה, שרירים) כדי לקבוע שינויים בספיגת הגלוקוז הקשורים ניוון עצבי.
הטכניקה המתוארת בפירוט כאן ניתן ליישם כדי למדוד את ספיגת הגלוקוז בסוג מסוים של עניין Drosophila חי באמצעות FLII12Pglu-700μδ6, חיישן מבוסס FRET אשר יכול לזהות שינויים ברמות הגלוקוז לטווח מילימולרי10,11,12. חיישן זה שימש בעבר בשילוב עם מערכת UAS-GAL4 כדי ל?…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לסטפני שירמאייר וטוקשי איווצובו על שסיפקו זני דרוזופילה. אנו מודים גם לפטרישיה ג’נסמה על הסיוע בהדמיה בליבת ההדמיה של מארלי באוניברסיטת אריזונה. עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות NIH NS091299, NS115514 (ל- DCZ), מלגת HHMI גיליאם (ל- EM) והתוכנית לחקר הביולוגיה לתואר ראשון (ל- HB).
35 mm tissue culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430165 | |
40X water immersion lens | Zeiss | 440090 | dippable, N.A. 0.8 |
dissection scissors | Roboz | RS-5618 | |
Dumont #5 forceps | VWR | 100189-236 | |
Dumont #55 forceps | VWR | 100189-244 | |
Minutien pins | Fine Science tools | 26002-10 | used for dissections |
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow | 1317318 | |
Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope | Zeiss | N/A |