Mesure de l’absorption du glucose dans les modèles de drosophile de la protéopathie TDP-43
Summary
L’absorption du glucose est augmentée dans les motoneurones de la drosophile affectés par la protéinopathie de la protéine de liaison à l’ADN TAR (TDP-43), comme l’indique un capteur de glucose génétiquement codé à base de FRET.
Abstract
La sclérose latérale amyotrophique est une maladie neurodégénérative provoquant une faiblesse musculaire progressive et la mort dans les 2 à 5 ans suivant le diagnostic. Les manifestations cliniques comprennent la perte de poids, la dyslipidémie et l’hypermétabolisme; cependant, on ne sait toujours pas comment ceux-ci sont liés à la dégénérescence des motoneurones. En utilisant un modèle de drosophile de la protéopathie TDP-43 qui récapitule plusieurs caractéristiques de la SLA, y compris les inclusions cytoplasmiques, le dysfonctionnement locomoteur et la durée de vie réduite, nous avons récemment identifié de vastes déficits métaboliques. Parmi ceux-ci, la glycolyse s’est avérée être régulée à la hausse et les expériences d’interaction génétique ont fourni des preuves d’un mécanisme neuroprotecteur compensatoire. En effet, malgré la régulation à la hausse de la phosphofructokinase, l’enzyme limitant le taux dans la glycolyse, il a été démontré qu’une augmentation de la glycolyse à l’aide de manipulations alimentaires et génétiques atténuait le dysfonctionnement locomoteur et augmentait la durée de vie dans les modèles de mouches de la protéinopathie TDP-43. Pour étudier plus avant l’effet de la protéinopathie TDP-43 sur le flux glycolytique dans les motoneurones, un capteur à base de FRET génétiquement codé précédemment, FLII12Pglu-700μδ6, a été utilisé. Ce capteur est composé d’un domaine de détection du glucose bactérien et de protéines fluorescentes cyan et jaunes comme la paire FRET. Lors de la liaison au glucose, le capteur subit un changement conformationnel permettant à FRET de se produire. En utilisant FLII12Pglu-700μδ6, l’absorption de glucose s’est avérée significativement augmentée dans les motoneurones exprimant TDP-43G298S, une variante causant la SLA. Ici, nous montrons comment mesurer l’absorption de glucose, ex vivo,dans les préparations larvaires du cordon nerveux ventral exprimant le capteur de glucose FLII12Pglu-700μδ6 dans le contexte de la protéinopathie TDP-43. Cette approche peut être utilisée pour mesurer l’absorption du glucose et évaluer le flux glycolytique dans différents types de cellules ou dans le contexte de diverses mutations causant la SLA et les troubles neurodégénératifs connexes.
Introduction
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative progressive qui est actuellement incurable. La SLA affecte les motoneurones supérieurs et inférieurs entraînant une perte de coordination motrice, une paralysie irréversible, une insuffisance respiratoire et la mort éventuelle dans les 2 à 5 ans suivant le diagnostic1. La SLA est associée à des défauts métaboliques tels que la perte de poids, la dyslipidémie et l’hypermétabolisme (examinés en2); cependant, on ne sait toujours pas comment ces altérations du métabolisme sont liées à la dégénérescence des motoneurones. Un dénominateur commun dans la SLA et les maladies neurodégénératives connexes est le TDP-43, une protéine de liaison aux acides nucléiques impliquée dans plusieurs étapes du traitement de l’ARN3,4,5. Bien que les mutations du TDP-43 n’affectent que 3% à 5% des patients, la protéine TDP-43 de type sauvage se trouve dans les agrégats cytoplasmiques dans >97% des cas de SLA (examinés dans6). Cette pathologie a été modélisée chez la drosophile par surexpression de type sauvage humain ou de TDP-43 mutant (G298S) dans les motoneurones, qui récapitule de multiples aspects de la SLA, notamment les inclusions cytoplasmiques, le dysfonctionnement locomoteur et la durée de vie réduite7,8. En utilisant ces modèles, il a été récemment rapporté que la protéinopathie TDP-43 provoque une augmentation significative des niveaux de pyruvate et d’ARNm phosphofructokinase (PFK), l’enzyme limitant le taux de glycolyse9. Des augmentations similaires des transcriptions de PFK ont été trouvées dans les motoneurones et la moelle épinière dérivés du patient, suggérant que la glycolyse est régulée à la hausse dans le contexte de la protéinopathie TDP-43. Fait intéressant, une augmentation supplémentaire de la glycolyse à l’aide de manipulations alimentaires et génétiques a atténué plusieurs phénotypes de la SLA tels que le dysfonctionnement locomoteur et l’augmentation de la durée de vie dans les modèles de mouche de la protéinopathie TDP-43, compatible avec un mécanisme neuroprotecteur compensatoire dans les motoneurones en dégénérescence.
Pour sonder davantage les changements dans la glycolyse et mesurer l’absorption du glucose dans les modèles de drosophile de la protéinopathie TDP-43, un capteur à base de FRET génétiquement codé précédemment FLII12Pglu-700μδ610 a été exprimé dans les motoneurones spécifiquement en utilisant le système d’expression UAS-GAL4. Le capteur de glucose FLII12Pglu-700μδ6 utilise le transfert d’énergie par résonance entre deux variantes de protéines fluorescentes vertes, les protéines fluorescentes cyan et jaunes (CFP et YFP) pour détecter le glucose au niveau cellulaire. Il s’agit d’un domaine de liaison au glucose bactérien du gène E. coli MglB fusionné à CFP et YFP aux extrémités opposées de la molécule. Lorsqu’il est lié à une molécule de glucose, le capteur subit un changement conformationnel rapprochant CFP et YFP et permettant à FRET de se produire, qui peut ensuite être utilisé pour quantifier les niveaux de glucose intracellulaire10,11,12 ( Figure1). Ici, nous montrons comment le capteur FLII12Pglu-700μδ6 peut être utilisé pour déterminer les changements dans l’absorption du glucose causés par la protéinopathie TDP-43 dans les motoneurones. Les expériences décrites ici montrent que la surexpression d’un mutant associé à la SLA, TDP-43G298S,dans les motoneurones provoque une augmentation significative de l’absorption de glucose par rapport aux témoins. Cette approche peut être utilisée dans d’autres types de SLA (p. ex. SOD1, C9orf72, etc.) et/ou d’autres types de cellules (p. ex. glie, muscles) pour déterminer les changements dans l’absorption du glucose associés à la neurodégénérescence.
Protocol
Representative Results
Discussion
La technique décrite en détail ici peut être appliquée pour mesurer l’absorption du glucose dans un type cellulaire spécifique d’intérêt chez la drosophile vivante en utilisant FLII12Pglu-700μδ6, un capteur basé sur FRET qui peut détecter les changements dans les niveaux de glucose à une gamme millimolaire10,11,12. Ce capteur a déjà été utilisé en conjonction avec le système UAS-GAL4 pour cibler so…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Stefanie Schirmeier et Takeshi Iwatsubo d’avoir fourni des souches de drosophiles. Nous remercions également Patricia Jansma d’avoir aidé à l’imagerie dans le Marley Imaging Core de l’Université de l’Arizona. Ce travail a été financé par les National Institutes of Health NIH NS091299, NS115514 (à DCZ), HHMI Gilliam Fellowship (à EM) et le undergraduate Biology Research Program (à HB).
Materials
| 35 mm tissue culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430165 | |
| 40X water immersion lens | Zeiss | 440090 | dippable, N.A. 0.8 |
| dissection scissors | Roboz | RS-5618 | |
| Dumont #5 forceps | VWR | 100189-236 | |
| Dumont #55 forceps | VWR | 100189-244 | |
| Minutien pins | Fine Science tools | 26002-10 | used for dissections |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow | 1317318 | |
| Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope | Zeiss | N/A |
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