Messung der Glukoseaufnahme in Drosophila-Modellen der TDP-43-Proteinopathie
Summary
Die Glukoseaufnahme ist in Drosophila-Motoneuronen erhöht, die von der TAR-DNA-bindenden Protein (TDP-43) -Proteinopathie betroffen sind, wie durch einen FRET-basierten, genetisch kodierten Glukosesensor angezeigt.
Abstract
Amyotrophe Lateralsklerose ist eine neurodegenerative Erkrankung, die innerhalb von 2-5 Jahren nach der Diagnose zu fortschreitender Muskelschwäche und Tod führt. Klinische Manifestationen umfassen Gewichtsverlust, Dyslipidämie und Hypermetabolismus; Es bleibt jedoch unklar, wie diese mit der Degeneration von Motoneuronen zusammenhängen. Unter Verwendung eines Drosophila-Modells der TDP-43-Proteinopathie, das mehrere Merkmale von ALS rekapituliert, einschließlich zytoplasmatischer Einschlüsse, lokomotorischer Dysfunktion und reduzierter Lebensdauer, haben wir kürzlich weitreichende Stoffwechseldefizite identifiziert. Unter diesen wurde festgestellt, dass die Glykolyse hochreguliert ist, und genetische Interaktionsexperimente lieferten Hinweise auf einen kompensatorischen neuroprotektiven Mechanismus. Trotz der Hochregulierung der Phosphofructokinase, dem geschwindigkeitsbegrenzenden Enzym in der Glykolyse, wurde gezeigt, dass eine Zunahme der Glykolyse unter Verwendung diätetischer und genetischer Manipulationen die Funktionsstörung des Lokomotors und die erhöhte Lebensdauer in Fliegenmodellen der TDP-43-Proteinopathie abschwächt. Um die Wirkung der TDP-43-Proteinopathie auf den glykolytischen Fluss in Motoneuronen weiter zu untersuchen, wurde ein zuvor berichteter genetisch kodierter, FRET-basierter Sensor, FLII12Pglu-700μδ6, verwendet. Dieser Sensor besteht aus einer bakteriellen Glukosesensordomäne und cyan- und gelb fluoreszierenden Proteinen als FRET-Paar. Bei der Glukosebindung erfährt der Sensor eine Konformationsänderung, die FRET ermöglicht. Unter Verwendung von FLII12Pglu-700μδ6 wurde festgestellt, dass die Glukoseaufnahme in Motoneuronen, die TDP-43G298Sexprimieren, signifikant erhöht ist, eine ALS-verursachende Variante. Hier zeigen wir, wie die Glukoseaufnahme ex vivoin larvalen ventralen Nervenstrangpräparaten gemessen werden kann, die den Glukosesensor FLII12Pglu-700μδ6 im Rahmen der TDP-43-Proteinopathie exprimieren. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um die Glukoseaufnahme zu messen und den glykolytischen Fluss in verschiedenen Zelltypen oder im Zusammenhang mit verschiedenen Mutationen, die ALS und verwandte neurodegenerative Erkrankungen verursachen, zu bewerten.
Introduction
Die Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine fortschreitende neurodegenerative Erkrankung, die derzeit unheilbar ist. ALS betrifft obere und untere Motoneuronen, was zu einem Verlust der motorischen Koordination, irreversibler Lähmung, Atemversagen und schließlich zum Tod innerhalb von 2-5 Jahren nach der Diagnoseführt 1. ALS ist mit Stoffwechseldefekten wie Gewichtsverlust, Dyslipidämie und Hypermetabolismus assoziiert (überprüft in2); Es bleibt jedoch unklar, wie diese Veränderungen im Stoffwechsel mit der Degeneration von Motoneuronen zusammenhängen. Ein gemeinsamer Nenner bei ALS und verwandten neurodegenerativen Erkrankungen ist TDP-43, ein Nukleinsäure-bindendes Protein, das an mehreren Schritten der RNA-Verarbeitung beteiligt ist3,4,5. Obwohl Mutationen in TDP-43 nur 3% -5% der Patienten betreffen, wird das Wildtyp-TDP-43-Protein in zytoplasmatischen Aggregaten in >97% der ALS-Fälle (überprüft in6) gefunden. Diese Pathologie wurde in Drosophila durch Überexpression von menschlichem Wildtyp oder mutantem TDP-43 (G298S) in Motoneuronen modelliert, was mehrere Aspekte von ALS rekapituliert, einschließlich zytoplasmatischer Einschlüsse, lokomotorischer Dysfunktion und reduzierter Lebensdauer7,8. Unter Verwendung dieser Modelle wurde kürzlich berichtet, dass die TDP-43-Proteinopathie einen signifikanten Anstieg der Pyruvatspiegel und der Phosphofructokinase (PFK) mRNA, dem geschwindigkeitsbegrenzenden Enzym der Glykolyse, verursacht9. Ähnliche Erhöhungen der PFK-Transkripte wurden in patienteneigenen Motoneuronen und Rückenmark gefunden, was darauf hindeutet, dass die Glykolyse im Zusammenhang mit der TDP-43-Proteinopathie hochreguliert ist. Interessanterweise milderte ein weiterer Anstieg der Glykolyse durch diätetische und genetische Manipulationen mehrere ALS-Phänotypen wie Lokomotorische Dysfunktion und erhöhte Lebensdauer in Fliegenmodellen der TDP-43-Proteinopathie, die mit einem kompensatorischen, neuroprotektiven Mechanismus in degenerierenden Motoneuronen übereinstimmen.
Um Veränderungen in der Glykolyse weiter zu untersuchen und die Glukoseaufnahme in Drosophila-Modellen der TDP-43-Proteinopathie zu messen, wurde ein zuvor berichteter genetisch kodierter FRET-basierter Sensor FLII12Pglu-700μδ610 in Motoneuronen speziell mit dem UAS-GAL4-Expressionssystem exprimiert. Der Glukosesensor FLII12Pglu-700μδ6 nutzt den Resonanzenergietransfer zwischen zwei Varianten des grün fluoreszierenden Proteins, cyanfarbene und gelb fluoreszierende Proteine (CFP und YFP), um Glukose auf zellulärer Ebene nachzuweisen. Es besteht aus einer bakteriellen Glukosebindungsdomäne aus dem E. coli MglB-Gen, das an gegenüberliegenden Enden des Moleküls mit CFP und YFP fusioniert ist. Wenn der Sensor an ein Glukosemolekül gebunden ist, erfährt er eine Konformationsänderung, die CFP und YFP näher zusammenbringt und FRET ermöglicht, die dann zur Quantifizierung der intrazellulären Glukosespiegel verwendet werden kann10,11,12 ( Abbildung1). Hier zeigen wir, wie der FLII12Pglu-700μδ6-Sensor verwendet werden kann, um Veränderungen der Glukoseaufnahme zu bestimmen, die durch TDP-43-Proteinopathie in Motoneuronen verursacht werden. Die hier beschriebenen Experimente zeigen, dass die Überexpression einer ALS-assoziierten Mutante, TDP-43G298S,in Motoneuronen einen signifikanten Anstieg der Glukoseaufnahme im Vergleich zu Kontrollen verursacht. Dieser Ansatz kann in anderen Arten von ALS (z. B. SOD1, C9orf72 usw.) und / oder anderen Zelltypen (z. B. Glia, Muskeln) verwendet werden, um Veränderungen der Glukoseaufnahme im Zusammenhang mit Neurodegeneration zu bestimmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier im Detail beschriebene Technik kann angewendet werden, um die Glukoseaufnahme in einem bestimmten Zelltyp von Interesse in lebender Drosophila mit FLII12Pglu-700μδ6 zu messen, einem FRET-basierten Sensor, der Änderungen des Glukosespiegels in einem Millimolarbereich10,11,12erkennen kann. Dieser Sensor wurde zuvor in Verbindung mit dem UAS-GAL4-System verwendet, um seine Expression auf bestimmte Zelltypen aus…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Stefanie Schirmeier und Takeshi Iwatsubo für die Bereitstellung von Drosophila-Sorten. Wir danken auch Patricia Jansma für die Unterstützung bei der Bildgebung im Marley Imaging Core an der University of Arizona. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health NIH NS091299, NS115514 (an DCZ), HHMI Gilliam Fellowship (an EM) und das Undergraduate Biology Research Program (an HB) finanziert.
Materials
| 35 mm tissue culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430165 | |
| 40X water immersion lens | Zeiss | 440090 | dippable, N.A. 0.8 |
| dissection scissors | Roboz | RS-5618 | |
| Dumont #5 forceps | VWR | 100189-236 | |
| Dumont #55 forceps | VWR | 100189-244 | |
| Minutien pins | Fine Science tools | 26002-10 | used for dissections |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow | 1317318 | |
| Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope | Zeiss | N/A |
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