Glucoseopname meten in Drosophila-modellen van TDP-43-proteïnopathie
Summary
Glucoseopname is verhoogd in Drosophila motorneuronen die worden beïnvloed door TAR DNA-bindend eiwit (TDP-43) proteïnopathie, zoals aangegeven door een FRET-gebaseerde, genetisch gecodeerde glucosesensor.
Abstract
Amyotrofische laterale sclerose is een neurodegeneratieve aandoening die progressieve spierzwakte en de dood veroorzaakt binnen 2-5 jaar na de diagnose. Klinische manifestaties omvatten gewichtsverlies, dyslipidemie en hypermetabolisme; het blijft echter onduidelijk hoe deze zich verhouden tot degeneratie van motorneuronen. Met behulp van een Drosophila-model van TDP-43-proteïnopathie dat verschillende kenmerken van ALS samenvat, waaronder cytoplasmatische insluitsels, locomotorische disfunctie en verminderde levensduur, hebben we onlangs brede metabole tekorten geïdentificeerd. Onder deze bleek glycolyse upregulated te zijn en genetische interactie-experimenten leverden bewijs voor een compenserend neuroprotectief mechanisme. Inderdaad, ondanks upregulatie van fosfoofructokinase, het snelheidsbeperkende enzym in glycolyse, werd aangetoond dat een toename van glycolyse met behulp van voedings- en genetische manipulaties locomotorische disfunctie en verhoogde levensduur in vliegmodellen van TDP-43 proteïnopathie. Om het effect op TDP-43 proteïnopathie op glycolytische flux in motorneuronen verder te onderzoeken, werd een eerder gerapporteerde genetisch gecodeerde, OP FRET gebaseerde sensor, FLII12Pglu-700μδ6, gebruikt. Deze sensor bestaat uit een bacterieel glucose-sensing domein en cyaan en gele fluorescerende eiwitten als het FRET-paar. Bij glucosebinding ondergaat de sensor een conformatieverandering waardoor FRET kan optreden. Met behulp van FLII12Pglu-700μδ6 bleek de glucoseopname significant verhoogd te zijn in motorneuronen die TDP-43G298Stot expressie brengen, een ALS-veroorzakende variant. Hier laten we zien hoe de glucoseopname ex vivokan worden gemeten in larvale ventrale zenuwstrengpreparaten die de glucosesensor FLII12Pglu-700μδ6 tot expressie brengen in de context van TDP-43-proteïnopathie. Deze benadering kan worden gebruikt om de glucoseopname te meten en de glycolytische flux te beoordelen in verschillende celtypen of in de context van verschillende mutaties die ALS en gerelateerde neurodegeneratieve aandoeningen veroorzaken.
Introduction
Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS) is een progressieve neurodegeneratieve aandoening die momenteel ongeneeslijk is. ALS beïnvloedt de bovenste en onderste motorneuronen, wat leidt tot verlies van motorische coördinatie, onomkeerbare verlamming, ademhalingsfalen en uiteindelijke dood binnen 2-5 jaar na diagnose1. ALS wordt geassocieerd met metabole defecten zoals gewichtsverlies, dyslipidemie en hypermetabolisme (beoordeeld in2); het blijft echter onduidelijk hoe deze veranderingen in het metabolisme zich verhouden tot degeneratie van motorneuronen. Een gemene deler bij ALS en gerelateerde neurodegeneratieve ziekten is TDP-43, een nucleïnezuurbindend eiwit dat betrokken is bij verschillende stappen van RNA-verwerking3,4,5. Hoewel mutaties in TDP-43 slechts 3%-5% van de patiënten treffen, wordt wild-type TDP-43-eiwit gevonden in cytoplasmatische aggregaten in >97% van de ALS-gevallen (beoordeeld in6). Deze pathologie werd gemodelleerd in Drosophila door overexpressie van het menselijke wildtype of mutant TDP-43 (G298S) in motorneuronen, die meerdere aspecten van ALS samenvatten, waaronder cytoplasmatische insluitsels, locomotorische disfunctie en verminderde levensduur7,8. Met behulp van deze modellen werd onlangs gemeld dat TDP-43 proteïnopathie een significante toename van pyruvaatspiegels en fosfoructokinase (PFK) mRNA veroorzaakt, het snelheidsbeperkende enzym glycolyse9. Vergelijkbare toenames in PFK-transcripten werden gevonden in patiënt-afgeleide motorneuronen en ruggenmerg, wat suggereert dat glycolyse upregulated is in de context van TDP-43 proteïnopathie. Interessant is dat een verdere toename van glycolyse met behulp van voedings- en genetische manipulaties verschillende ALS-fenotypen zoals locomotorische disfunctie en verhoogde levensduur in vliegmodellen van TDP-43-proteïnopathie verminderde, consistent met een compenserend, neuroprotectief mechanisme in degenererende motorneuronen.
Om veranderingen in glycolyse verder te onderzoeken en de glucoseopname in Drosophila-modellen van TDP-43-proteïnopathie te meten, werd een eerder gerapporteerde genetisch gecodeerde FRET-gebaseerde sensor FLII12Pglu-700μδ610 uitgedrukt in motorneuronen specifiek met behulp van het UAS-GAL4-expressiesysteem. De FLII12Pglu-700μδ6 glucosesensor maakt gebruik van resonantie-energieoverdracht tussen twee varianten van groen fluorescerend eiwit, cyaan en gele fluorescerende eiwitten (CFP en YFP) om glucose op cellulair niveau te detecteren. Het bestaat uit een bacterieel glucosebindend domein van het E. coli MglB-gen gefuseerd met CFP en YFP aan tegenovergestelde uiteinden van het molecuul. Wanneer de sensor aan een glucosemolecuul wordt gebonden, ondergaat deze een conformatieverandering die CFP en YFP dichter bij elkaar brengt en FRET mogelijk maakt, die vervolgens kan worden gebruikt om intracellulaire glucosespiegels10,11,12 te kwantificeren(figuur 1). Hier laten we zien hoe de FLII12Pglu-700μδ6-sensor kan worden gebruikt om veranderingen in glucoseopname veroorzaakt door TDP-43-proteïnopathie in motorneuronen te bepalen. De hier beschreven experimenten tonen aan dat overexpressie van een ALS-geassocieerde mutant, TDP-43G298S, in motorneuronen een significante toename van de glucoseopname veroorzaakt in vergelijking met controles. Deze aanpak kan worden gebruikt in andere soorten ALS (bijv. SOD1, C9orf72, enz.) en/of andere celtypen (bijv. glia, spieren) om veranderingen in glucoseopname geassocieerd met neurodegeneratie te bepalen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier in detail beschreven techniek kan worden toegepast om de glucoseopname te meten in een specifiek celtype van belang in levende Drosophila met behulp van FLII12Pglu-700μδ6, een fret-gebaseerde sensor die veranderingen in glucosespiegels kan detecteren tot een millimolair bereik10,11,12. Deze sensor is eerder gebruikt in combinatie met het UAS-GAL4-systeem om de expressie ervan te richten op specifieke celtypen,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken Stefanie Schirmeier en Takeshi Iwatsubo voor het leveren van Drosophila-soorten. We bedanken ook Patricia Jansma voor het assisteren bij beeldvorming in de Marley Imaging Core aan de Universiteit van Arizona. Dit werk werd gefinancierd door National Institutes of Health NIH NS091299, NS115514 (naar DCZ), HHMI Gilliam Fellowship (naar EM) en het Undergraduate Biology Research Program (naar HB).
Materials
| 35 mm tissue culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430165 | |
| 40X water immersion lens | Zeiss | 440090 | dippable, N.A. 0.8 |
| dissection scissors | Roboz | RS-5618 | |
| Dumont #5 forceps | VWR | 100189-236 | |
| Dumont #55 forceps | VWR | 100189-244 | |
| Minutien pins | Fine Science tools | 26002-10 | used for dissections |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow | 1317318 | |
| Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope | Zeiss | N/A |
References
- Ingre, C., Roos, P. M., Piehl, F., Kamel, F., Fang, F. Risk factors for amyotrophic lateral sclerosis. Clinical Epidemiology. 7, 181-193 (2015).
- Dupuis, L., Pradat, P. F., Ludolph, A. C., Loeffler, J. P. Energy metabolism in amyotrophic lateral sclerosis. The Lancet Neurology. 10 (1), 75-82 (2011).
- Buratti, E., Baralle, F. E. Characterization and functional implications of the RNA binding properties of nuclear factor TDP-43, a novel splicing regulator of CFTR exon 9. The Journal of Biological Chemistry. 276 (39), 36337-36343 (2001).
- Polymenidou, M., et al. Long pre-mRNA depletion and RNA missplicing contribute to neuronal vulnerability from loss of TDP-43. Nature Neuroscience. 14 (4), 459-468 (2011).
- Tollervey, J. R., et al. Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43. Nature Neuroscience. 14 (4), 452-458 (2011).
- Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis. Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).
- Estes, P. S., et al. Wild-type and A315T mutant TDP-43 exert differential neurotoxicity in a Drosophila model of ALS. Human Molecular Genetics. 20 (12), 2308-2321 (2011).
- Estes, P. S., et al. Motor neurons and glia exhibit specific individualized responses to TDP-43 expression in a Drosophila model of amyotrophic lateral sclerosis. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 721-733 (2013).
- Manzo, E., et al. Glycolysis upregulation is neuroprotective as a compensatory mechanism in ALS. eLife. 8, 45114 (2019).
- Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain. Journal of Insect Physiology. 106, 55-64 (2018).
- Fehr, M., Lalonde, S., Lager, I., Wolff, M. W., Frommer, W. B. In vivo imaging of the dynamics of glucose uptake in the cytosol of COS-7 cells by fluorescent nanosensors. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19127-19133 (2003).
- Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochimedica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).
- Ihara, R., et al. RNA binding mediates neurotoxicity in the transgenic Drosophila model of TDP-43 proteinopathy. Human Molecular Genetics. 22 (22), 4474-4484 (2013).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Diaz-Garcia, C. M., et al. Quantitative in vivo imaging of neuronal glucose concentrations with a genetically encoded fluorescence lifetime sensor. Journal of Neuroscience Research. 97 (8), 946-960 (2019).
- Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function. Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).
- Lu, B., Vogel, H. Drosophila models of neurodegenerative diseases. Annual Review of Pathology. 4, 315-342 (2009).
