测量TDP-43蛋白病果 蝇 模型中的葡萄糖摄取
Summary
受 TAR DNA 结合蛋白 （TDP-43） 蛋白病影响 的果蝇 运动神经元中的葡萄糖摄取增加，如基于 FRET 的遗传编码葡萄糖传感器所示。
Abstract
肌萎缩性侧索硬化症是一种神经退行性疾病，在诊断后 2-5 年内导致进行性肌无力和死亡。临床表现包括体重减轻、血脂异常和代谢亢进。然而，目前尚不清楚这些与运动神经元变性的关系。使用TDP-43蛋白病的 果蝇 模型，该模型概括了ALS的几个特征，包括细胞质包涵体，运动功能障碍和寿命缩短，我们最近发现了广泛的代谢缺陷。其中，糖酵解被发现是上调的，遗传相互作用实验为代偿性神经保护机制提供了证据。事实上，尽管磷酸果糖激酶（糖酵解中的限速酶）的上调，但使用饮食和遗传操作增加糖酵解被证明可以减轻运动功能障碍并延长TDP-43蛋白病苍蝇模型的寿命。为了进一步研究TDP-43蛋白病对运动神经元糖酵解通量的影响，使用了先前报道的遗传编码的基于FRET的传感器FLII12Pglu-700μδ6。该传感器由细菌葡萄糖传感域和青色和黄色荧光蛋白组成，作为FRET对。葡萄糖结合后，传感器发生构象变化，允许发生FRET。使用FLII12Pglu-700μδ6，发现表达TDP-43G298S的运动神经元（一种引起ALS的变异体）的葡萄糖摄取显着增加。在这里，我们展示了如何在TDP-43蛋白病的背景下测量表达葡萄糖传感器FLII12Pglu-700μδ6的幼虫腹侧神经索制剂中的葡萄糖摄取， 离体。这种方法可用于测量葡萄糖摄取并评估不同细胞类型或导致ALS和相关神经退行性疾病的各种突变的糖酵解通量。
Introduction
肌萎缩性侧索硬化症（ALS）是一种进行性神经退行性疾病，目前无法治愈。ALS 影响上下运动神经元，导致运动协调丧失、不可逆性瘫痪、呼吸衰竭，并在诊断后 2-5 年内最终死亡1。ALS与代谢缺陷有关，例如体重减轻，血脂异常和代谢亢进（第2篇综述）;然而，目前尚不清楚这些代谢变化与运动神经元变性的关系。ALS和相关神经退行性疾病的一个共同点是TDP-43，这是一种参与RNA处理3，4，5的几个步骤的核酸结合蛋白。虽然TDP-43的突变仅影响3%-5%的患者，但在>97%的ALS病例的细胞质聚集体中发现了野生型TDP-43蛋白（在6中回顾）。这种病理学是通过运动神经元中人类野生型或突变TDP-43（G298S）的过表达在果蝇中建模的，这概括了ALS的多个方面，包括细胞质包涵体，运动功能障碍和寿命缩短7，8。使用这些模型，最近报道TDP-43蛋白病导致丙酮酸水平和磷酸果糖糖激酶（PFK）mRNA（糖酵解9的限速酶）显着增加。在患者来源的运动神经元和脊髓中发现了PFK转录本的类似增加，这表明在TDP-43蛋白病的背景下糖酵解被上调。有趣的是，使用饮食和遗传操作进一步增加糖酵解减轻了几种ALS表型，如运动功能障碍和TDP-43蛋白病苍蝇模型中寿命的增加，与退行性运动神经元的补偿性神经保护机制一致。
为了进一步探索糖酵解的变化并测量TDP-43蛋白病果蝇模型中的葡萄糖摄取，先前报道的基于FRET的遗传编码传感器FLII12Pglu-700μδ610专门使用UAS-GAL4表达系统在运动神经元中表达。FLII12Pglu-700μδ6葡萄糖传感器使用两种绿色荧光蛋白变体（青色和黄色荧光蛋白（CFP和YFP）之间的共振能量转移来检测细胞水平的葡萄糖。它由来自大肠杆菌MglB基因的细菌葡萄糖结合结构域组成，该基因融合到分子两端的CFP和YFP。当与葡萄糖分子结合时，传感器经历构象变化，使CFP和YFP更紧密地结合在一起并允许FRET发生，然后可用于量化细胞内葡萄糖水平10，11，12（图1）。在这里，我们展示了FLII12Pglu-700μδ6传感器如何用于确定由运动神经元中TDP-43蛋白病引起的葡萄糖摄取变化。这里描述的实验表明，与对照组相比，运动神经元中ALS相关突变体TDP-43G298S的过表达会导致葡萄糖摄取显着增加。这种方法可用于其他类型的ALS（例如，SOD1，C9orf72等）和/或其他细胞类型（例如，神经胶质细胞，肌肉），以确定与神经变性相关的葡萄糖摄取的变化。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里详细描述的技术可以应用于使用FLII12Pglu-700μδ6测量活果蝇感兴趣的特定细胞类型的葡萄糖摄取，FLII12Pglu-700μδ6是基于FRET的传感器，可以检测葡萄糖水平的变化到毫摩尔范围10，11，12。该传感器以前曾与UAS-GAL4系统结合使用，以将其表达靶向特定的细胞类型，包括神经元9，10?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢Stefanie Schirmeier和Takeshi Iwatsubo提供 果蝇 菌株。我们还感谢Patricia Jansma协助亚利桑那大学Marley Imaging Core的成像工作。这项工作由美国国立卫生研究院NIH NS091299，NS115514（到DCZ），HHMI Gilliam奖学金（到EM）和本科生生物学研究计划（到HB）资助。
Materials
| 35 mm tissue culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430165 | |
| 40X water immersion lens | Zeiss | 440090 | dippable, N.A. 0.8 |
| dissection scissors | Roboz | RS-5618 | |
| Dumont #5 forceps | VWR | 100189-236 | |
| Dumont #55 forceps | VWR | 100189-244 | |
| Minutien pins | Fine Science tools | 26002-10 | used for dissections |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow | 1317318 | |
| Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope | Zeiss | N/A |
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