ヒト多能性幹細胞スフェロイドを担持したコアシェル型マイクロカプセルのマイクロ流体作製
Summary
この記事では、同軸流集束装置を用いたヒト多能性幹細胞(hPSC)のカプセル化について説明する。我々は、このマイクロ流体封止技術がhPSCスフェロイドの効率的な形成を可能にすることを実証する。
Abstract
ヒト多能性幹細胞(hPSC)の三次元(3D)またはスフェロイド培養は、分化転帰およびスケーラビリティの改善という利点を提供する。本稿では、コアシェルマイクロカプセル内にhPSCを閉じ込めるために同軸流集束装置を利用するhPSCスフェロイドの堅牢で再現性のある形成のための戦略を説明する。コア溶液はhPSCsの単一細胞懸濁液を含み、高分子量ポリ(エチレングリコール)(PEG)および密度勾配培地の混入によって粘性を持たせた。シェルストリームはPEG-4アームマレイミドまたはPEG-4-Malで構成され、コアストリームに沿って2つの連続したオイルジャンクションに向かって流れました。液滴形成は、シェル溶液がコアの周りに自分自身を包み込む最初のオイル接合部で起こった。シェルの化学的架橋は、これらの液滴にジチオール架橋剤(1,4−ジチオスレイトールまたはDTT)を導入することによって、第2の油接合部で起こった。架橋剤は、クリック化学 を介して マレイミド官能基と反応し、マイクロカプセルの周囲にヒドロゲルシェルを形成する。当社のカプセル化技術は、直径400μmのカプセルを毎秒10カプセルの割合で製造しました。得られたカプセルは、ヒドロゲルシェルと水性コアを有し、単一細胞が迅速に凝集体に集合し、スフェロイドを形成することを可能にする。カプセル化のプロセスはhPSCの生存率に悪影響を及ぼさず、カプセル化後3日目に>95%の生存率が観察された。比較のために、固体ゲル微粒子(水性コアなし)に封入されたhPSCはスフェロイドを形成せず、封入後3日目に<50%の生存率を有していた。コアシェル型マイクロカプセル内のhPSCのスフェロイド形成は、封入後48時間以内に起こり、スフェロイド直径は細胞接種密度の関数である。全体として、このプロトコルに記載されているマイクロ流体カプセル化技術は、hPSCsカプセル化および回転楕円体形成に適していた。
Introduction
ヒト多能性幹細胞(hPSC)の3D培養には、この培養フォーマットによってもたらされる改善された多能性および分化能のためにかなりの関心がある1、2、3。hPSCは、典型的には、バイオリアクター、マイクロウェル、ヒドロゲル、およびポリマー足場4、5、6によってスフェロイドまたは他の3D培養フォーマットに成形される。カプセル化は、単一のhPSCを回転楕円体に編成するための別の手段を提供する。一旦カプセル化されたhPSCスフェロイドは、容易に取り扱い、分化、疾患モデリング、または薬物検査実験のためにマイクロタイタープレートに移され得る。ヒドロゲル層にhPSCを包み込むと、剪断損傷から細胞を保護し、バイオリアクター内でスフェロイドを高い攪拌速度で培養することができます7。
幹細胞カプセル化のための私たちの方法論は、時間の経過とともに進化しました。まず、固体ヒドロゲル微粒子に着目し、マウス胚性幹細胞(mESC)の内包・培養に成功したことを実証しました8。しかし、ヒト胚性幹細胞(hESC)は、このようなヒドロゲル微粒子に封入した場合の生存率が低いことが注目されたが、これはおそらく、これらの細胞が封入後に細胞間接触を再確立する必要性が大きいためである。我々は、水性コアを有する不均一なマイクロカプセルが、細胞間接触の迅速な再確立に依存する細胞のカプセル化に適している可能性があると推論した。水性コア/ヒドロゲルシェルマイクロカプセルを製造するための同軸流集束マイクロ流体装置の概念は、He et al.9から適応されたが、元のアプローチで採用されたアルギン酸塩の代わりに、PEGベースのヒドロゲルがシェルに組み込まれた。我々はまず、コアシェル型マイクロカプセル10 における初代肝細胞のカプセル化およびスフェロイド形成の成功を実証し、最近ではhESおよびiPS細胞のカプセル化7について説明した。 図1Aで概説されているように、カプセルは、シェルおよびコアの流れが油相に放出される前に、左右から同軸の流れに移行するフロー集束装置内で製造される。コアフローには溶液の粘度を増加させる細胞および添加剤(非反応性PEG MW 35kDおよびイオジキサノール – 商品名OptiPrep)が含まれ、シェルストリームには反応性分子(PEG-4-Mal)が含まれています。連続的な同軸流流は、コアシェルアーキテクチャを保持する液滴に離散化される。コアシェル構造は、クリック化学 を介して PEG-4-Malと反応し、薄い(〜10μm)ヒドロゲルスキンまたはシェルの形成をもたらすジチオール架橋剤(DTT)への曝露によって恒久的になる。エマルジョンが破壊され、カプセルが水相に移された後、PEGの分子はコアから拡散し、水分子によって置き換えられる。これは、水性コアおよびヒドロゲルシェルマイクロカプセルをもたらす。
以下に、マイクロ流体デバイスの製造方法、細胞の調製方法、およびhPSCのカプセル化方法に関するステップバイステップの手順を示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するカプセル化プロセスは、hPSCスフェロイドの再現性のある形成をもたらす。マイクロカプセル形式により、分化プロトコルの改善/最適化または治療法の試験を目的とした実験のために、マイクロタイタープレートのウェルにスフェロイドを簡単に分配できます。封入幹細胞スフェロイドは、ヒドロゲルシェルが剪断誘発損傷から細胞を保護する懸濁培養においても使用され得?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、メイヨー・クリニック再生医療センター、J・W・キークヘファー財団、アル・ナヒヤン財団、ミネソタ州再生医療(RMM 101617 TR 004)、NIH(DK107255)からの助成金によって部分的に支援された。
Materials
| 0.22 µm Syringe Filters | Genesee Scientific | 25-244 | |
| 1 ml syringe luer-lock tip | BD | 309628 | |
| 1x DPBS | Corning | 23220003 | |
| 4-arm PEG maleimide, 10kDa | Laysan Inc. | 164-68 | |
| 5 ml syringe luer-lock tip | BD | 309646 | |
| 6-WELL NON-TREATED PLATE | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Aquapel Applicator Pack | Aquapel Glass Treatment | 47100 | |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
| CELL STRAINER 100 µm pore size | cardinal | 335583 | |
| Chlorotrimethylsilane | Aldrich | 386529-100mL | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Life technology | A27974 | |
| Digital hot plate | Dataplate | ||
| Digital vortex mixer | Fisher Scientific | 215370 | |
| Distilled water | Gibco | 15230-162 | |
| Dithiotheritol (DTT) | Sigma | D0632-10G | |
| DMEM/F12 media | gibco | 11320-033 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge | live | 13-100-675 | |
| HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Inverted Fluorescence Motorized Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Laurell Spin Coaters | Laurell Technologies | WS-650MZ-23NPPB | |
| Live/Dead mammalian staining kit | Fisher | L3224 | |
| Magic tape | Staples | 483535 | |
| Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.) | Scientific Commodities, Inc | BB31695-PE/2 | |
| Micro stir bar | Daigger Scientific | EF3288E | |
| MilliporeSigma Filter Forceps | Fisher scientific | XX6200006P | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | |
| mTeSR 1 Basal Medium | STEMCELL TECHNOLOGY | 85850 | |
| Needles-Stainless Steel 14 Gauge | CML supply | 901-14-025 | |
| Needles-Stainless Steel 15 Gauge | CML supply | 901-15-050 | |
| OptiPrep | STEMCELL TECHNOLOGY | 7820 | |
| Oven | Thermo Scientific | HERA THERM Oven | |
| Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin) | Gemini | 400-109 | |
| Petri Dish 150X20 Sterile Vent | Sarstedt, Inc. | 82.1184.500 | |
| Plasma Cleaning System | Yield Engineering System, Inc. | YES-G500 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| Poly(ethylene glycol) 35kDa | Sigma | 94646-250G-F | |
| PrecisionGlide Needle 27G | BD | 305109 | |
| Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride | SELLECK CHEM | S1049-10mg | |
| Silicon wafer 100mm | University Wafer | 452 | |
| Slide glass (75mm ´ 25mm) | CardinalHealth | M6146 | |
| Span 80 | Sigma | S6760-250ML | |
| SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
| Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm) | Costar | 8160 | |
| SU-8 2025 | Kayaku Advanced Materials | Y111069 0500L1GL | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials | Y020100 4000L1PE | |
| Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades | fisher scientific | 22-079-684 | |
| SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 2065622 | |
| Syringe pump | New Era Pump System, Inc | NE-4000 | |
| Triethanolamine | Sigma-aldrich | T58300-25G | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
| Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-04 | |
| Ultrasonic cleaner FS20D | Fisher Scientific | CPN-962-152R | |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42025-0000 | |
| Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
| μPG 101 laser writer | Heidelberg Instruments | HI 1128 |
References
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