인간 다능성 줄기 세포 구상체를 운반하는 코어-쉘 마이크로캡슐의 미세유체 제조
Summary
이 기사는 동축 유동 초점 장치를 사용하여 인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)의 캡슐화를 설명합니다. 우리는이 미세 유체 캡슐화 기술이 hPSC 구상체의 효율적인 형성을 가능하게한다는 것을 보여줍니다.
Abstract
인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)의 3차원 (3D) 또는 스페로이드 배양은 향상된 분화 결과 및 확장성의 이점을 제공한다. 이 논문에서는 동축 흐름 초점 장치를 사용하여 코어 쉘 마이크로 캡슐 내부에 hPSC를 포획하는 hPSC 구상체의 견고하고 재현 가능한 형성을위한 전략을 설명합니다. 코어 용액은 hPSCs의 단일 세포 현탁액을 함유하고, 고분자량 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 및 밀도 구배 매질의 혼입에 의해 점성으로 만들어졌다. 쉘 스트림은 PEG-4 암-말레이미드 또는 PEG-4-Mal로 구성되고, 코어 스트림과 함께 두 개의 연속적인 오일 접합부를 향해 흘렀다. 액적 형성은 첫 번째 오일 접합부에서 발생했으며 쉘 용액은 코어 주위를 감싸고 있습니다. 쉘의 화학적 가교결합은 이들 액적에 디티올 가교결합제(1,4-디티오트레이톨 또는 DTT)를 도입함으로써 제2 오일 접합부에서 발생하였다. 가교제는 클릭 화학을 통해 말레이미드 작용기와 반응하여 마이크로 캡슐 주위에 하이드로겔 쉘을 형성합니다. 당사의 캡슐화 기술은 초당 10 캡슐의 속도로 직경 400 μm 캡슐을 생산했습니다. 결과 캡슐에는 하이드로겔 쉘과 수성 코어가있어 단일 세포가 응집체로 빠르게 조립되어 구상체를 형성 할 수있었습니다. 캡슐화 과정은 hPSCs의 생존력에 악영향을 미치지 않았으며, 캡슐화 후 3 일 동안 관찰 된 >95 %의 생존력으로 나타났습니다. 비교를 위해, (수성 코어 없이) 고체 겔 미세입자로 캡슐화된 hPSCs는 구상체를 형성하지 않았고, 캡슐화 3일 후에 <50%의 생존력을 가졌다. 코어-쉘 마이크로캡슐 내부의 hPSCs의 스페로이드 형성은 캡슐화 후 48시간 이내에 발생했으며, 스페로이드 직경은 세포 접종 밀도의 함수이다. 전반적으로, 이 프로토콜에 기술된 미세유체 캡슐화 기술은 hPSCs 캡슐화 및 스페로이드 형성에 매우 적합하였다.
Introduction
인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)의 3D 배양에는 이러한 배양 형식 1,2,3에 의해 제공되는 향상된 다능성 및 분화 잠재력으로 인해 상당한 관심이 있다. hPSC는 전형적으로 생물반응기, 마이크로웰, 하이드로겔 및 중합체성 스캐폴드 4,5,6을 통해 구상체 또는 다른 3D 배양 포맷으로 형성된다. 캡슐화는 단일 hPSC를 구상체로 조직하는 또 다른 방법을 제공합니다. 일단 캡슐화된 hPSC 구상체는 용이하게 처리되고 분화, 질병 모델링, 또는 약물 시험 실험을 위해 마이크로타이터 플레이트로 옮겨질 수 있다. 하이드로겔 층에 hPSC를 포위하는 것은 또한 전단 손상으로부터 세포를 보호하고, 높은 교반 속도로 생물반응기에서 구상체를 배양할 수 있게한다(7).
줄기 세포 캡슐화에 대한 우리의 방법론은 시간이 지남에 따라 진화했습니다. 첫째, 우리는 고체 하이드로겔 미세입자에 초점을 맞추고 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs)의 성공적인 캡슐화 및 배양을 입증했습니다8. 그러나, 인간 배아줄기세포(hESCs)는 이러한 하이드로겔 마이크로입자에 캡슐화될 때 생존율이 낮으며, 아마도 캡슐화 후 세포-세포 접촉을 재확립하기 위해 이들 세포가 더 많이 필요하기 때문인 것으로 추정된다. 우리는 수성 코어를 소유하고있는 이종 마이크로 캡슐이 세포 – 세포 접촉의 신속한 재 확립에 의존하는 세포의 캡슐화에 더 적합 할 수 있다고 추론했다. 수성 코어/하이드로겔 쉘 마이크로캡슐을 제조하기 위한 동축 유동 포커싱 마이크로유체 장치의 개념은 He et al.9에서 채택되었지만, 원래의 접근법에 사용된 알지네이트 대신에, PEG 기반 하이드로겔이 쉘에 통합되었다. 우리는 먼저 코어-쉘 마이크로캡슐(10 )에서 원발성 간세포의 성공적인 캡슐화 및 스페로이드 형성을 입증하였고, 가장 최근에 hES 및 iPS 세포(7)의 캡슐화를 기술하였다. 도 1A에 요약된 바와 같이, 캡슐은 오일 페이즈로 토출되기 전에 쉘 및 코어 유동 스트림이 좌우에서 동축 흐름으로 전환되는 흐름 집속 장치로 제조된다. 코어 흐름에는 용액의 점도를 증가시키는 세포 및 첨가제 (비 반응성 PEG MW 35kD 및 iodixanol – 상업명 OptiPrep)가 포함되어 있으며 쉘 스트림에는 반응성 분자 (PEG-4-Mal)가 포함되어 있습니다. 연속 동축 흐름 스트림은 코어 쉘 아키텍처를 유지하는 물방울로 이산화됩니다. 코어-쉘 구조는 디티올 가교제(DTT)에 노출됨으로써 영구적으로 만들어지며, 이는 클릭 화학을 통해 PEG-4-Mal과 반응하여 얇은(~10 μm) 하이드로겔 피부 또는 쉘의 형성을 초래한다. 에멀젼이 깨지고 캡슐이 수성상으로 옮겨지면 PEG 분자가 코어에서 확산되어 물 분자로 대체됩니다. 이로 인해 수성 코어 및 하이드로겔 쉘 마이크로캡슐이 생성됩니다.
아래에는 미세 유체 장치를 만드는 방법, 세포를 준비하는 방법 및 hPSC의 캡슐화를 수행하는 방법에 대한 단계별 지침이 제공됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 캡슐화 과정은 hPSC 구상체의 재현 가능한 형성을 초래한다. 마이크로 캡슐 형식을 사용하면 분화 프로토콜 개선 / 최적화 또는 치료법 테스트를 목표로하는 실험을 위해 구상체를 마이크로 타이터 플레이트의 웰에 쉽게 분배 할 수 있습니다. 캡슐화된 줄기 세포 구상체는 또한 하이드로겔 쉘이 전단-유도된 손상으로부터 세포를 보호하는 현탁 배양물에서 사용될 수 있다<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, J. W. Kieckhefer Foundation, Al Nahyan Foundation, Regenerative Medicine Minnesota (RMM 101617 TR 004) 및 NIH (DK107255)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| 0.22 µm Syringe Filters | Genesee Scientific | 25-244 | |
| 1 ml syringe luer-lock tip | BD | 309628 | |
| 1x DPBS | Corning | 23220003 | |
| 4-arm PEG maleimide, 10kDa | Laysan Inc. | 164-68 | |
| 5 ml syringe luer-lock tip | BD | 309646 | |
| 6-WELL NON-TREATED PLATE | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Aquapel Applicator Pack | Aquapel Glass Treatment | 47100 | |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
| CELL STRAINER 100 µm pore size | cardinal | 335583 | |
| Chlorotrimethylsilane | Aldrich | 386529-100mL | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Life technology | A27974 | |
| Digital hot plate | Dataplate | ||
| Digital vortex mixer | Fisher Scientific | 215370 | |
| Distilled water | Gibco | 15230-162 | |
| Dithiotheritol (DTT) | Sigma | D0632-10G | |
| DMEM/F12 media | gibco | 11320-033 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge | live | 13-100-675 | |
| HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Inverted Fluorescence Motorized Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Laurell Spin Coaters | Laurell Technologies | WS-650MZ-23NPPB | |
| Live/Dead mammalian staining kit | Fisher | L3224 | |
| Magic tape | Staples | 483535 | |
| Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.) | Scientific Commodities, Inc | BB31695-PE/2 | |
| Micro stir bar | Daigger Scientific | EF3288E | |
| MilliporeSigma Filter Forceps | Fisher scientific | XX6200006P | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | |
| mTeSR 1 Basal Medium | STEMCELL TECHNOLOGY | 85850 | |
| Needles-Stainless Steel 14 Gauge | CML supply | 901-14-025 | |
| Needles-Stainless Steel 15 Gauge | CML supply | 901-15-050 | |
| OptiPrep | STEMCELL TECHNOLOGY | 7820 | |
| Oven | Thermo Scientific | HERA THERM Oven | |
| Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin) | Gemini | 400-109 | |
| Petri Dish 150X20 Sterile Vent | Sarstedt, Inc. | 82.1184.500 | |
| Plasma Cleaning System | Yield Engineering System, Inc. | YES-G500 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| Poly(ethylene glycol) 35kDa | Sigma | 94646-250G-F | |
| PrecisionGlide Needle 27G | BD | 305109 | |
| Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride | SELLECK CHEM | S1049-10mg | |
| Silicon wafer 100mm | University Wafer | 452 | |
| Slide glass (75mm ´ 25mm) | CardinalHealth | M6146 | |
| Span 80 | Sigma | S6760-250ML | |
| SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
| Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm) | Costar | 8160 | |
| SU-8 2025 | Kayaku Advanced Materials | Y111069 0500L1GL | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials | Y020100 4000L1PE | |
| Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades | fisher scientific | 22-079-684 | |
| SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 2065622 | |
| Syringe pump | New Era Pump System, Inc | NE-4000 | |
| Triethanolamine | Sigma-aldrich | T58300-25G | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
| Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-04 | |
| Ultrasonic cleaner FS20D | Fisher Scientific | CPN-962-152R | |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42025-0000 | |
| Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
| μPG 101 laser writer | Heidelberg Instruments | HI 1128 |
References
- Zhu, Z., Huangfu, D. Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology. Development. 140 (4), 705-717 (2013).
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).
- Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).
- Lei, Y., Schaffer, D. V. A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).
- Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
- Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).
- Fattahi, P., et al. Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor. Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).
- Siltanen, C., et al. Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids. Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).
- Agarwal, P., et al. One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells. Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).
- Siltanen, C., et al. One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids. Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).
- Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood. ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).
- Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).
- Shin, D. S., et al. Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells. Angewandte Chemie International Edition. , (2014).
- You, J., et al. Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells. Advanced Functional Materials. , (2015).
