En förenklad modell för heterotopisk hjärtklafftransplantation hos gnagare

Summary

Detta protokoll beskriver en enkel och effektiv metod för transplantation av aortaklaffblad under njurkapseln för att möjliggöra studier av alloreaktivitet hos hjärtklaffar.

Abstract

Det finns ett akut kliniskt behov av hjärtklaffsersättningar som kan växa hos barn. Hjärtklaffstransplantation föreslås som en ny typ av transplantation med potential att leverera hållbara hjärtklaffar som kan somatisk tillväxt utan krav på antikoagulation. Immunobiologin för hjärtklafftransplantationer förblir dock outforskad, vilket belyser behovet av djurmodeller för att studera denna nya typ av transplantation. Tidigare råttmodeller för heterotopisk aortaklafftransplantation i bukaorta har beskrivits, även om de är tekniskt utmanande och kostsamma. För att ta itu med denna utmaning utvecklades en renal subkapsulär transplantationsmodell hos gnagare som en praktisk och enklare metod för att studera hjärtklafftransplantationsimmunbiologi. I denna modell skördas en enda aortaklaffbroschyr och sätts in i njursubkapsulärt utrymme. Njuren är lättillgänglig och den transplanterade vävnaden finns säkert i ett subkapsulärt utrymme som är väl vaskulärt och rymmer en mängd olika vävnadsstorlekar. Dessutom, eftersom en enda råtta kan ge tre donator aorta broschyrer och en enda njure kan ge flera platser för transplanterad vävnad, krävs färre råttor för en given studie. Här beskrivs transplantationstekniken, vilket ger ett betydande steg framåt i att studera transplantationsimmunologin vid hjärtklafftransplantation.

Introduction

Medfödda hjärtfel är den vanligaste medfödda funktionsnedsättningen hos människor och drabbar 7 av 1 000 levande födda barn varje år¹. Till skillnad från vuxna patienter där olika mekaniska och bioprostetiska ventiler rutinmässigt implanteras, har pediatriska patienter för närvarande inga bra alternativ för ventilbyte. Dessa konventionella implantat har inte potential att växa hos mottagande barn. Som ett resultat krävs sjukliga omoperationer för att byta ut hjärtklaffimplantaten mot successivt större versioner när barnen växer, med drabbade barn som ofta kräver upp till fem eller fler öppna hjärtoperationer under sin livstid ^2,3. Studier har visat att friheten från intervention eller död är signifikant dålig för spädbarn än äldre barn, med 60% av spädbarn med protetiska hjärtklaffar som står inför återoperation eller död inom 3 år efter deras första operation⁴. Därför finns det ett akut behov av att leverera en hjärtklaff som kan växa och upprätthålla funktion hos pediatriska patienter.

I årtionden har försök att leverera växande hjärtklaffsersättningar varit centrerade på vävnadsteknik och stamceller. Försök att översätta dessa ventiler till kliniken har dock hittills misslyckats 5,6,7,8. För att ta itu med detta föreslås en hjärtklafftransplantation som en mer kreativ operation för att leverera växande hjärtklaffsersättningar som har förmågan att själv reparera och undvika trombogenes. Istället för att transplantera hela hjärtat transplanteras bara hjärtklaffen och kommer sedan att växa med mottagarbarnet, liknande konventionella hjärttransplantationer eller en Ross lungaugraf ^9,10,11. Postoperativt kommer mottagarbarn att få immunsuppression tills den transplanterade ventilen kan bytas ut mot en mekanisk protes i vuxenstorlek när ventilens tillväxt inte längre krävs. Transplantationsbiologin för hjärtklafftransplantationstransplantat förblir dock outforskad. Därför behövs djurmodeller för att studera denna nya typ av transplantation.

Flera råttmodeller har tidigare beskrivits för heterotopisk transplantation av aortaklaffen i bukaorta 12,13,14,15,16,17,18. Dessa modeller är dock oöverkomligt knepiga och kräver ofta utbildade kirurger för att fungera framgångsrikt. Dessutom är de kostsamma och tidskrävande¹⁹. En ny råttmodell utvecklades för att skapa en enklare djurmodell för att studera immunbiologin vid hjärtklaffstransplantationer. Enstaka aortaklaffblad skärs ut och sätts in i njursubkapsulärt utrymme. Njuren är särskilt lämpad för att studera transplantationsavstötning eftersom den är mycket vaskulär med tillgång till cirkulerande immunceller ^20,21. Medan flera andra har använt en renal subkapsulär modell för att studera transplantationsbiologin för andra allografttransplantationer som bukspottkörtel, lever, njure och hornhinna 22,23,24,25,26,27, är detta den första beskrivningen av transplantation av hjärtvävnad i denna position. Här beskrivs transplantationstekniken, vilket ger ett betydande steg framåt i att studera transplantationsimmunologin vid hjärtklafftransplantation.

Protocol

Studien godkändes av kommittén för djurförsök efter National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals. 1. Information om djurmodellen (råttor) Använd ett operationsmikroskop (se materialtabell) med upp till 20x förstoring för alla kirurgiska ingrepp. Använd syngena (som Lewis-Lewis) eller allogena (som Lewis-Brown Norge) stammar för transplantationerna efter behov för experimentet. Använd råttor i åldern mel…

Representative Results

En grafisk avbildning av den experimentella designen tillhandahålls för råttmodellen (figur 1). Dessutom visas en aortarot som dissekeras från donatorns hjärta och en individuell aortaklaffbroschyr som är förberedd för implantation i figur 2. Därefter visas en representativ bild av positionen för aortaklaffbroschyren under njurkapseln för implantation i figur 3A och efter 3, 7 och 28 dagar inom mottagarråttan (<strong cl…

Discussion

Betydelse och potentiella tillämpningar
Medan mekaniska och bioprostetiska hjärtklaffar rutinmässigt används hos vuxna patienter som behöver ventilbyte, saknar dessa ventiler potential att växa och är därför suboptimala för pediatriska patienter. Hjärtklaffstransplantation är en experimentell operation som är utformad för att leverera växande hjärtklaffersättningar för nyfödda och spädbarn med medfödd hjärtsjukdom. Men till skillnad från transplantationsimmunbiologin för konven…

Materials

0.9% Sodium Chlordie, USP	Baxter	NDC 0338-0048-04
4-0 Polyglactin 910	Ethicon	J415H
7.5% Povidone-Iodine	CareFusion	29904-004
70% ETOH	Fisher Scientific	BP82031GAL
Anesthesia induction chamber	Harvard Apparatus	75-2030	Air-tight inducton chamber for rats
Anesthesia machine	Harvard Apparatus	75-0238	Mobile Anesthesia System with Passive Scavenging
Anesthesia Mask	Harvard Apparatus	59-8255	Rat anesthesia mask
Brown Norway Rats (BN/Crl)	Charles River	Strain Code 091	Male, 5-7 weeks, 100-200 g
Buprenorphine Hydrochloride, 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05	0.03 mg/kg, administered subcutaneously
Electric hair clippers	WAHL	79434
Electric Heating Pad	Harvard Apparatus	72-0492	Maintained at 36-38 °C
Heparin	Sagent Pharmaceuticals	NDC 25021-400-10	100U/100g injection into the left atrium
Insulin Syringe, 1 mL	Fisher Scientific	14-841-33
Iris forceps curved	World Precision Instruments	15917
Iris forceps straight	World Precision Instruments	15916
Isoflurane, USP	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25	Induced at 5% isoflurance in oxygen and maintained with 3.5% isoflurane in oxygen
Lewis Rats (LEW/ Crl)	Charles River	Strain Code 004	Male, 5-7 weeks, 100-200 g
Micro forceps	World Precision Instruments	500233	Dumont #5
Micro scissors	World Precision Instruments	501930	Spring-loaded Vannas Scissors
Needle Driver	World Precision Instruments	500226	Ryder Needle Driver
Operating microscope	AmScope	SM-3BZ-80S	3.5x – 90x Stereo Microscope
Petri Dish	Fisher Scientific	FB0875714
Petrolatum ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17033-211-38
Skin staples	Ethicon	PXR35	Proximate 35
Sterile cotton swabs	Puritan	25-806 1WC
Sterile gauze sponges	Fisher Scientific	22-037-902
Surgical Scissors	World Precision Instruments	1962C	Metzenbaum Scissors
University of Wisconsin Buffer (Servator B)	S.A.L.F S.p.A.	6484A1	Stored at 4 °C