Hale vene transsektion blødning model i fuldt bedøvet hæmofili A mus

Summary

Den raffinerede halevenetranssektion (TVT) blødningsmodel i bedøvede mus er en følsom in vivo-metode til vurdering af hæmofil blødning. Denne optimerede TVT-blødningsmodel bruger blodtab og blødningstid som endepunkter, forfiner andre modeller og undgår død som et endepunkt.

Abstract

Haleblødningsmodeller er vigtige værktøjer i hæmofiliforskning, specifikt til vurdering af prokoagulerende virkninger. Overlevelsesmodellen for halevenetranssektion (TVT) er blevet foretrukket i mange indstillinger på grund af følsomhed over for klinisk relevante doser af FVIII, mens andre etablerede modeller, såsom haleclipsmodellen, kræver højere niveauer af prokoagulerende forbindelser. For at undgå at bruge overlevelse som endepunkt udviklede vi en TVT-model, der etablerede blodtab og blødningstid som endepunkter og fuld bedøvelse under hele eksperimentet. Kort fortalt placeres bedøvede mus med halen nedsænket i tempereret saltvand (37 ° C) og doseres med testforbindelsen i højre laterale halevene. Efter 5 min krydses den venstre laterale halevene ved hjælp af en skabelonguide, halen returneres til saltvandet, og alle blødningsepisoder overvåges og registreres i 40 minutter, mens blodet opsamles. Hvis der ikke opstår blødning 10 min, 20 min eller 30 min efter skaden, udfordres blodproppen forsigtigt ved at tørre snittet to gange med en våd gazepind. Efter 40 minutter kvantificeres blodtab ved mængden af hæmoglobin, der blødte ind i saltvandet. Denne hurtige og relativt enkle procedure resulterer i ensartede og reproducerbare blødninger. Sammenlignet med TVT-overlevelsesmodellen bruger den en mere human procedure uden at gå på kompromis med følsomheden over for farmakologisk intervention. Desuden er det muligt at bruge begge køn, hvilket reducerer det samlede antal dyr, der skal opdrættes, i overensstemmelse med principperne i 3R’er. En potentiel begrænsning i blødningsmodeller er den stokastiske karakter af hæmostase, som kan reducere reproducerbarheden af modellen. For at imødegå dette sikrer manuel blodpropforstyrrelse, at blodproppen udfordres under overvågning, hvilket forhindrer primær (blodplade) hæmostase i at stoppe blødningen. Denne tilføjelse til kataloget over blødningsskademodeller giver mulighed for at karakterisere prokoagulerende virkninger på en standardiseret og human måde.

Introduction

Dyremodeller er afgørende for at forstå patogenesen af hæmofili og udvikle og teste behandlingsregimer og terapier. Faktor VIII knock-out mus (F8-KO) er en meget anvendt model til undersøgelse af hæmofili A ^1,2. Disse mus rekapitulerer nøglefunktioner i sygdommen og er blevet brugt i vid udstrækning til udvikling af behandlinger, såsom rekombinante FVIII-produkter ^3,4,5 og genterapistrategier ^6,7.

Der er forskellige blødningsskademodeller til evaluering af de farmakologiske virkninger af forskellige hæmostatiske forbindelser in vivo. En af disse koagulationsmodeller er overlevelsesmodellen for halevenetranssektion hos mus 8,9,10,11,12,13,14, der måler hæmofile mus evne til at overleve ekssanguination efter haletranssektion. Denne metode blev introduceret for mere end fire årtier siden¹⁵ og bruges stadig ^9,16,17. Modellen bruger dog overlevelse som endepunkt og kræver observation af dyrene over en periode på op til 24 timer, hvor dyrene er ved bevidsthed og dermed kan opleve smerte og angst.

Blødningsmodeller af kortere varighed og under fuld bedøvelse er tidligere beskrevet, såsom haleclipsmodellen (også kendt som halespidsen)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Ikke desto mindre kræver disse modeller doser af prokoagulerende forbindelser (f.eks. FVIII) langt højere end dem, der administreres klinisk²⁹ for en fuldstændig normalisering af blodtab efter blødningsudfordringen. En anden skadesmodel under anæstesi, vena saphena blødningsmetoden, er følsom over for lavere doser af prokoagulerende forbindelser³⁰, men kræver et højt niveau af eksperimentatorintervention, da blodpropperne skal forstyrres ofte (i modsætning til 3 gange i den præsenterede model).

Standardisering i retning af en fælles protokol til test af nye prokoagulerende forbindelser ville i høj grad lette datasammenligningen mellem laboratorier 31,32,33. I TVT-modeller er der endnu ikke en fælles aftale om studerede endepunkter (blodtab ^7,26, blødningstid ^9,34 og overlevelsesrate^35,36), og eksperimentel længde varierer mellem undersøgelse¹³.

Vores primære mål er at beskrive og karakterisere en optimeret model med høj reproducerbarhed, muligheden for at studere on-demand samt en profylaktisk behandling, følsomhed over for farmakologisk intervention svarende til overlevelsesmodellen, men ikke ved at bruge død eller nærdød som endepunkter. For at mindske smerte og angst bør dyrene ikke være bevidste under blødning, og der skal gennemføres et mere etisk endepunkt³⁷.

Haleclipsmodeller udføres generelt i en af to varianter, enten amputering af halespidsen, f.eks. amputation af 1-5 mm 18,19,20,21,23,24 eller i en mere alvorlig variant transekteret med en halediameter omkring 1-3 mm ^8,22,25 . Dette medfører en kombineret arteriovenøs blødning, da laterale og dorsale vener og ventral arterie normalt afskæres, og generelt jo større amputationen er, desto lavere er følsomheden over for en prokoagulerende forbindelse. Da halespidsen er amputeret, udsættes den arteriovenøse skade desuden uden noget modsat væv; således er det i det mindste i teorien forskelligt fra de mest almindelige hæmofile blødninger.

Som navnet antyder, er det kun venen, der er skadet i halevenetranssektionsmodeller som beskrevet i dette papir, hvilket resulterer i en udelukkende venøs blødning. Da karret ikke er helt afskåret, forventes skaden at være mindre end i amputationsmodellerne, og vævet omkring snittet, som en blodprop kan klæbe til, bevares. Derudover er der lavere blodtryk i venen i modsætning til arterien. Disse faktorer bidrager til en øget følsomhed i forhold til amputationsmodeller, således at normalisering af blødning kan opnås med klinisk relevante doser substitutionsterapi, fx med rFVIII i hæmofili A, hvilket er nyttigt til evaluering af størrelsen og holdbarheden af virkningerne af prokoagulerende behandling 26,38,39.

Protocol

Alle procedurer, der er beskrevet i denne protokol, er godkendt af Dyrevelfærdsorganet hos Novo Nordisk A/S og Dyreforsøgstilsynet, Ministeriet for Fødevarer, Landbrug og Fiskeri. Den optimerede 40 minutters metode inkluderer anæstesi og doseringstid i designet (figur 1). Hæmofile mus af begge køn mellem 10-16 uger er nødvendige for denne procedure. 1. Forberedelser før undersøgelsen Forbered doseringsopløsningerne i de korrekte koncentrationer…

Representative Results

For at vurdere anvendeligheden af den optimerede model blev der udført en undersøgelse i F8-KO (C57BL genetisk baggrund) mus administreret med en kommercielt tilgængelig rekombinant faktor VIII substitutionsterapi (rFVIII); fire forskellige doser blev testet: 1 IE/kg, 5 IE/kg, 10 IE/kg og 20 IE/kg. Desuden testede vi den tilsvarende køretøjs (negative) kontrol i F8-KO-mus og vildtype (WT) gruppe ved hjælp af C57BL-mus som en positiv kontrolgruppe for at vurdere responsområdet i modellen. <p class="jove_content…

Discussion

Denne optimerede metode til halevenetranssektion (TVT) har flere fordele sammenlignet med TVT-overlevelsesmetoden. Dyrene bedøves fuldt ud i hele forsøgsperioden, hvilket gør musehåndtering lettere og øger dyrenes trivsel. I modsætning til TVT-overlevelsesmodellen er der ikke behov for observation natten over, og denne optimerede model giver mulighed for at måle blodtab og observere den nøjagtige blødningstid over 40 minutter. Også længere perioder med blødning hos bevidste dyr kan forårsage død ved ekssang…

Materials

#11 Scalpel blade	Swann-Morton	503
15 mL centrifuge tubes	Greiner Bio-One, Austria	188271
30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing	BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe	320830
Advate	Takeda, Japan		Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII)
Alcohol pads 70% ethanol	Hartmann, Soft-Zellin	999 979
Centrifuge	Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech
Cutting template (Stainless steel)	Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings		Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm
Erythrocytes (RBC) lysing solution	Lysebio, ABX Diagnostics	906012
Gauze
Haematological analyser	Sysmex	CT-2000iv
Heating lamp on stand	Phillips	IR250
Heating pad with thermostat	CMA	model 150
Hemoglobin standards and controls – 8.81 mmol / l batch dependent	HemoCue, Denmark	HemoCue calibrator, 707037	Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH).
Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box	Sigma Delta Dameca
Isoflurane	Baxter	26675-46-7
Magnifier with lights	Eschenbach
Measuring template (Aluminum)	Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings		Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm
Micropipettes + tips	Finnpipette
Photometer	Molecular Devices Corporation, CA, USA	SpectraMax 340 photometer
Prism Software	GraphPad, San Diego, CA, USA	Version 9.0.1
Saline 0.9% NaCl	Fresenius Kabi, Sweden	883264
Special tail marker block for TVT tail cut
Tail holder
Vacuum liquid suction	Vacusafe comfort, IBS
Waterbath and thermostat	TYP 3/8 Julabo