Tam Anestezi Uygulanan Hemofili A Farelerinde Kuyruk Ven Transeksiyonu Kanama Modeli
Summary
Anestezi uygulanan farelerde rafine kuyruk veni transeksiyonu (TVT) kanama modeli, hemofilik kanamanın değerlendirilmesinde duyarlı bir in vivo yöntemdir. Bu optimize edilmiş TVT kanama modeli, kan kaybını ve kanama süresini bitiş noktaları olarak kullanır, diğer modelleri rafine eder ve son nokta olarak ölümden kaçınır.
Abstract
Kuyruk kanaması modelleri, hemofili araştırmalarında, özellikle prokoagülan etkilerin değerlendirilmesinde önemli araçlardır. Kuyruk veni transeksiyonu (TVT) sağkalım modeli, klinik olarak ilgili FVIII dozlarına duyarlılık nedeniyle birçok ortamda tercih edilirken, kuyruk klipsi modeli gibi diğer yerleşik modeller daha yüksek seviyelerde prokoagülan bileşikler gerektirir. Sağkalımı son nokta olarak kullanmaktan kaçınmak için, tüm deney boyunca kan kaybını ve kanama süresini son nokta ve tam anestezi olarak belirleyen bir TVT modeli geliştirdik. Kısaca, anestezi uygulanan fareler, ılıman saline (37 ° C) batırılmış kuyruk ile yerleştirilir ve sağ lateral kuyruk damarındaki test bileşiği ile dozlanır. 5 dakika sonra, sol lateral kuyruk damarı bir şablon kılavuzu kullanılarak transekte edilir, kuyruk saline geri döndürülür ve kan toplanırken tüm kanama bölümleri izlenir ve 40 dakika boyunca kaydedilir. Yaralanma sonrası 10 dakika, 20 dakika veya 30 dakika kanama meydana gelmezse, kesiği ıslak bir gazlı bezle iki kez silerek pıhtıya hafifçe meydan okunur. 40 dakika sonra, kan kaybı, saline kanan hemoglobin miktarı ile ölçülür. Bu hızlı ve nispeten basit prosedür, tutarlı ve tekrarlanabilir kanamalarla sonuçlanır. TVT sağkalım modeline kıyasla, farmakolojik müdahaleye duyarlılıktan ödün vermeden daha insancıl bir prosedür kullanır. Ayrıca, her iki cinsiyeti de kullanmak, yetiştirilmesi gereken toplam hayvan sayısını azaltarak, 3R’lerin ilkelerine bağlı kalarak mümkündür. Kanama modellerinde potansiyel bir sınırlama, hemostazın stokastik doğasıdır ve bu da modelin tekrarlanabilirliğini azaltabilir. Buna karşı koymak için, manuel pıhtı bozulması, izleme sırasında pıhtıya meydan okunmasını sağlar ve primer (trombosit) hemostazın kanamayı durdurmasını önler. Kanama yaralanması modelleri kataloğuna yapılan bu ekleme, prokoagülan etkileri standartlaştırılmış ve insancıl bir şekilde karakterize etme seçeneği sunar.
Introduction
Hayvan modelleri, hemofilinin patogenezini anlamak ve tedavi rejimleri ve terapileri geliştirmek ve test etmek için gereklidir. Faktör VIII nakavt fare (F8-KO), hemofili A 1,2 çalışması için yaygın olarak kullanılan bir modeldir. Bu fareler hastalığın temel özelliklerini özetler ve rekombinant FVIII ürünleri 3,4,5 ve gen terapisi stratejileri 6,7 gibi tedavilerin geliştirilmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır.
Farklı hemostatik bileşiklerin in vivo farmakolojik etkilerini değerlendirmek için çeşitli kanama hasarı modelleri vardır. Bu pıhtılaşma modellerinden biri, 8,9,10,11,12,13,14 numaralı farelerde kuyruk veni transeksiyonu sağkalım modelidir ve hemofilik farelerin kuyruk transeksiyonu sonrası ekssanguinasyondan kurtulma yeteneğini ölçer. Bu yöntem kırk yıldan fazla bir süre önce15 tanıtıldı ve halakullanılıyor 9,16,17. Bununla birlikte, model hayatta kalmayı bir son nokta olarak kullanır ve hayvanların bilinçli olduğu ve dolayısıyla acı ve sıkıntı yaşayabileceği 24 saate kadar bir süre boyunca hayvanların gözlemlenmesini gerektirir.
Kuyruk klipsi modeli (kuyruk ucu olarak da bilinir) 8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 gibi daha kısa süreli ve tam anestezi altındaki kanama modelleri daha önce tanımlanmıştır. . Bununla birlikte, kanama zorluğundan sonra kan kaybının tamamen normalleşmesi için, bu modeller klinik olarak uygulananlardan çok daha yüksek prokoagülan bileşiklerin (örneğin, FVIII) dozlarını gerektirir29. Anestezi altında farklı bir yaralanma modeli olan vena safena kanama yöntemi, daha düşük dozlarda prokoagülan bileşiklere duyarlıdır30, ancak pıhtıların sık sık bozulması gerektiğinden (sunulan modelde 3 kez aksine) yüksek düzeyde deneyci müdahalesi gerektirir.
Yeni prokoagülan bileşikleri test etmek için ortak bir protokole yönelik standardizasyon, laboratuvarlar arasında veri karşılaştırmasını büyük ölçüde kolaylaştıracaktır31,32,33. TVT modellerinde, çalışılan son noktalar (kan kaybı 7,26, kanama süresi 9,34 ve sağkalım oranı 35,36) konusunda henüz ortak bir anlaşma yoktur ve deneysel uzunluk çalışmalararasında değişmektedir 13.
Birincil hedefimiz, yüksek tekrarlanabilirliğe sahip optimize edilmiş bir modeli, isteğe bağlı çalışma imkanının yanı sıra profilaktik bir tedaviyi, hayatta kalma modeline eşdeğer farmakolojik müdahaleye duyarlılığı, ancak ölümü veya ölüme yakın olanı son nokta olarak kullanmamayı tanımlamak ve karakterize etmektir. Ağrı ve sıkıntıyı azaltmak için hayvanların kanama sırasında bilinçli olmamaları ve daha etik bir son nokta uygulanması gerekmektedir37.
Kuyruk klipsi modelleri genellikle kuyruğun ucunu keserek, örneğin 1-5 mm 18,19,20,21,23,24 amputasyonu veya daha şiddetli bir varyantta, 1-3 mm 8,22,25 civarında bir kuyruk çapında transekte edilen iki varyanttan birinde gerçekleştirilir. . Bu, lateral ve dorsal damarlar ve ventral arter genellikle koptuğu için kombine bir arteriyovenöz kanamaya neden olur ve genel olarak, amputasyon ne kadar büyük olursa, prokoagülan bir bileşiğe duyarlılık o kadar düşük olur. Ayrıca, kuyruk ucu kesildiğinden, arteriyovenöz yaralanma herhangi bir karşıt doku olmadan maruz kalır; Bu nedenle, en azından teoride, en yaygın hemofilik kanamalardan farklıdır.
Adından da anlaşılacağı gibi, bu makalede açıklandığı gibi kuyruk veni transeksiyon modellerinde sadece damar yaralanır, böylece sadece venöz kanama ile sonuçlanır. Damar tamamen kopmadığından, yaralanmanın amputasyon modellerinden daha küçük olması beklenir ve bir pıhtının yapışabileceği kesik çevresindeki doku korunur. Ek olarak, arterin aksine damarda daha düşük kan basıncı vardır. Bu faktörler, amputasyon modellerine göre artan bir duyarlılığa katkıda bulunur, böylece kanamanın normalizasyonu, klinik olarak ilgili replasman tedavisi dozlarıyla, örneğin hemofili A’da rFVIII ile, prokoagülan tedavinin etkilerinin büyüklüğünü ve dayanıklılığını değerlendirmek için yararlıdır 26,38,39.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu optimize edilmiş kuyruk veni transeksiyonu (TVT) yöntemi, TVT sağkalım yöntemine kıyasla birçok avantaja sahiptir. Hayvanlar, tüm çalışma süresi boyunca tamamen anestezi altına alınır, bu da fare kullanımını kolaylaştırır ve hayvan refahını arttırır. Ayrıca, TVT hayatta kalma modelinin aksine, gece boyunca gözlem gerekli değildir ve bu optimize edilmiş model, kan kaybını ölçme ve 40 dakika boyunca tam kanama süresini gözlemleme imkanı sunar. Ayrıca, bilinçli hayvanlarda daha uzun …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esther Bloem ve Thomas Nygaard, plazmadaki FVIII ölçümleri ile destek için kabul edildi. Bo Alsted, şablonu ve kesme bloklarını çizmek ve işlemek için kabul edilmektedir.
Materials
| #11 Scalpel blade | Swann-Morton | 503 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One, Austria | 188271 | |
| 30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing | BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe | 320830 | |
| Advate | Takeda, Japan | Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII) | |
| Alcohol pads 70% ethanol | Hartmann, Soft-Zellin | 999 979 | |
| Centrifuge | Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech | ||
| Cutting template (Stainless steel) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm | |
| Erythrocytes (RBC) lysing solution | Lysebio, ABX Diagnostics | 906012 | |
| Gauze | |||
| Haematological analyser | Sysmex | CT-2000iv | |
| Heating lamp on stand | Phillips | IR250 | |
| Heating pad with thermostat | CMA | model 150 | |
| Hemoglobin standards and controls – 8.81 mmol / l batch dependent | HemoCue, Denmark | HemoCue calibrator, 707037 | Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH). |
| Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box | Sigma Delta Dameca | ||
| Isoflurane | Baxter | 26675-46-7 | |
| Magnifier with lights | Eschenbach | ||
| Measuring template (Aluminum) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm | |
| Micropipettes + tips | Finnpipette | ||
| Photometer | Molecular Devices Corporation, CA, USA | SpectraMax 340 photometer | |
| Prism Software | GraphPad, San Diego, CA, USA | Version 9.0.1 | |
| Saline 0.9% NaCl | Fresenius Kabi, Sweden | 883264 | |
| Special tail marker block for TVT tail cut | |||
| Tail holder | |||
| Vacuum liquid suction | Vacusafe comfort, IBS | ||
| Waterbath and thermostat | TYP 3/8 Julabo |
References
- Bi, L., et al. Targeted disruption of the mouse factor VIII gene produces a model of haemophilia A. Nature Genetics. 10 (1), 119-121 (1995).
- Bi, L., et al. Further characterization of factor VIII-deficient mice created by gene targeting: RNA and protein studies. Blood. 88 (9), 3446-3450 (1996).
- Stennicke, H. R., et al. A novel B-domain O-glycoPEGylated FVIII (N8-GP) demonstrates full efficacy and prolonged effect in hemophilic mice models. Blood. 121 (11), 2108-2116 (2013).
- Shapiro, A. D. Anti-hemophilic factor (recombinant), plasma/albumin-free method (octocog-alpha; ADVATE) in the management of hemophilia A. Vascular Health and Risk Management. 3 (5), 555-565 (2007).
- Recht, M., et al. Clinical evaluation of moroctocog alfa (AF-CC), a new generation of B-domain deleted recombinant factor VIII (BDDrFVIII) for treatment of haemophilia A: demonstration of safety, efficacy, and pharmacokinetic equivalence to full-length recombinant factor VIII. Haemophilia. 15 (4), 869-880 (2009).
- Miao, C. H., et al. CD4+FOXP3+ regulatory T cells confer long-term regulation of factor VIII-specific immune responses in plasmid-mediated gene therapy-treated hemophilia mice. Blood. 114 (19), 4034-4044 (2009).
- Milanov, P., et al. Engineered factor IX variants bypass FVIII and correct hemophilia A phenotype in mice. Blood. 119 (2), 602-611 (2012).
- Dumont, J. A., et al. Prolonged activity of a recombinant factor VIII-Fc fusion protein in hemophilia A mice and dogs. Blood. 119 (13), 3024-3030 (2012).
- Pan, J., et al. Enhanced efficacy of recombinant FVIII in noncovalent complex with PEGylated liposome in hemophilia A mice. Blood. 114 (13), 2802-2811 (2009).
- Liu, T., et al. Improved coagulation in bleeding disorders by Non-Anticoagulant Sulfated Polysaccharides (NASP). Journal of Thrombosis and Haemostasis. 95 (1), 68-76 (2006).
- Brooks, A. R., et al. Glycoengineered factor IX variants with improved pharmacokinetics and subcutaneous efficacy. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (9), 1699-1706 (2013).
- Baru, M., et al. Factor VIII efficient and specific non-covalent binding to PEGylated liposomes enables prolongation of its circulation time and haemostatic efficacy. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 93 (6), 1061-1068 (2005).
- Molina, E. S., Fujita, A., Sogayar, M. C., Demasi, M. A. A quantitative and humane tail bleeding assay for efficacy evaluation of antihaemophilic factors in haemophilia A mice. Haemophilia. 20 (6), 392-398 (2014).
- Broze, G. J., Yin, Z. F., Lasky, N. A tail vein bleeding time model and delayed bleeding in hemophiliac mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 85 (4), 747-748 (2001).
- Dejana, E., Callioni, A., Quintana, A., de Gaetano, G. Bleeding time in laboratory animals. II – A comparison of different assay conditions in rats. Thrombosis Research. 15 (1-2), 191-197 (1979).
- Girard, T. J., Lasky, N. M., Grunz, K., Broze, G. J. Suppressing protein Z-dependent inhibition of factor Xa improves coagulation in hemophilia A. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (1), 149-156 (2019).
- Zhang, J. P., et al. Curing hemophilia A by NHEJ-mediated ectopic F8 insertion in the mouse. Genome Biology. 20 (1), 276 (2019).
- Sambrano, G. R., Weiss, E. J., Zheng, Y. W., Huang, W., Coughlin, S. R. Role of thrombin signalling in platelets in haemostasis and thrombosis. Nature. 413 (6851), 74-78 (2001).
- Tranholm, M., et al. Improved hemostasis with superactive analogs of factor VIIa in a mouse model of hemophilia A. Blood. 102 (10), 3615-3620 (2003).
- Mei, B., et al. Rational design of a fully active, long-acting PEGylated factor VIII for hemophilia A treatment. Blood. 116 (2), 270-279 (2010).
- Karpf, D. M., et al. Prolonged half-life of glycoPEGylated rFVIIa variants compared to native rFVIIa. Thrombosis Research. 128 (2), 191-195 (2011).
- Ivanciu, L., et al. A zymogen-like factor Xa variant corrects the coagulation defect in hemophilia. Nature Biotechnology. 29 (11), 1028-1033 (2011).
- Ostergaard, H., et al. Prolonged half-life and preserved enzymatic properties of factor IX selectively PEGylated on native N-glycans in the activation peptide. Blood. 118 (8), 2333-2341 (2011).
- Maroney, S. A., et al. Absence of hematopoietic tissue factor pathway inhibitor mitigates bleeding in mice with hemophilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3927-3931 (2012).
- Holmberg, H. L., Lauritzen, B., Tranholm, M., Ezban, M. Faster onset of effect and greater efficacy of NN1731 compared with rFVIIa, aPCC and FVIII in tail bleeding in hemophilic mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 7 (9), 1517-1522 (2009).
- Johansen, P. B., Tranholm, M., Haaning, J., Knudsen, T. Development of a tail vein transection bleeding model in fully anaesthetized haemophilia A mice – characterization of two novel FVIII molecules. Haemophilia. 22 (4), 625-631 (2016).
- Ferrière, S., et al. A hemophilia A mouse model for the in vivo assessment of emicizumab function. Blood. 136 (6), 740-748 (2020).
- Elm, T., et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of a new recombinant FVIII (N8) in haemophilia A mice. Haemophilia. 18 (1), 139-145 (2012).
- Björkman, S. Prophylactic dosing of factor VIII and factor IX from a clinical pharmacokinetic perspective. Haemophilia. 9, 101-108 (2003).
- Pastoft, A. E., et al. A sensitive venous bleeding model in haemophilia A mice: effects of two recombinant FVIII products (N8 and Advate). Haemophilia. 18 (5), 782-788 (2012).
- Saito, M. S., et al. New approaches in tail-bleeding assay in mice: improving an important method for designing new anti-thrombotic agents. International Journal of Experimental Pathology. 97 (3), 285-292 (2016).
- Liu, Y., Jennings, N. L., Dart, A. M., Du, X. J. Standardizing a simpler, more sensitive and accurate tail bleeding assay in mice. World Journal of Experimental Medicine. 2 (2), 30-36 (2012).
- Greene, T. K., et al. Towards a standardization of the murine tail bleeding model. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (12), 2820-2822 (2010).
- Cerullo, V., et al. Correction of murine hemophilia A and immunological differences of factor VIII variants delivered by helper-dependent adenoviral vectors. Molecular Therapy. 15 (12), 2080-2087 (2007).
- Shi, Q., et al. Factor VIII ectopically targeted to platelets is therapeutic in hemophilia A with high-titer inhibitory antibodies. Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1974-1982 (2006).
- Parker, E. T., Lollar, P. A quantitative measure of the efficacy of factor VIII in hemophilia A mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 89 (3), 480-485 (2003).
- Stokes, W. S. Reducing Unrelieved Pain and Distress in Laboratory Animals Using Humane Endpoints. ILAR Journal. 41 (2), 59-61 (2000).
- Stagaard, R., et al. Abrogating fibrinolysis does not improve bleeding or rFVIIa/rFVIII treatment in a non-mucosal venous injury model in haemophilic rodents. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (7), 1369-1382 (2018).
- Stagaard, R., et al. Absence of functional compensation between coagulation factor VIII and plasminogen in double-knockout mice. Blood Advances. 2 (22), 3126-3136 (2018).
- Bolton-Maggs, P. H., Pasi, K. J. Haemophilias A and B. Lancet. 361 (9371), 1801-1809 (2003).
- Lloyd Jones, M., Wight, J., Paisley, S., Knight, C. Control of bleeding in patients with haemophilia A with inhibitors: a systematic review. Haemophilia. 9 (4), 464-520 (2003).
- Sixma, J. J., vanden Berg, A. The haemostatic plug in haemophilia A: a morphological study of haemostatic plug formation in bleeding time skin wounds of patients with severe haemophilia A. British Journal of Haematology. 58 (4), 741-753 (1984).
- Proulle, V., et al. Recombinant activated factor VII-induced correction of bleeding tendency in genetically engineered von Willebrand disease type 2B mice evaluated using new tail transection bleeding models. International Society on Thrombosis and Haemostasis Congress. , (2017).
- Rode, F., et al. Preclinical pharmacokinetics and biodistribution of subcutaneously administered glycoPEGylated recombinant factor VIII (N8-GP) and development of a human pharmacokinetic prediction model. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (6), 1141-1152 (2018).
- Holmberg, H., et al. GlycoPEGylated rFVIIa (N7-GP) has a prolonged hemostatic effect in hemophilic mice compared with rFVIIa. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (5), 1070-1072 (2011).
- Kawecki, C., et al. Posters Abstracts – Thrombin-mediated Activation of Factor VIII is Insufficient to Produce All Necessary Cofactor Activity in vivo. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 3, 1 (2019).
- Johansen, P., et al. In vivo effect of recombinant FVIIA (NOVOSEVEN®) and RFIX in a refined tail vein transection bleeding model in mice with haemophilia A and B: PO147-MON. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13, (2015).
- Enoksson, M., et al. Enhanced potency of recombinant factor VIIa with increased affinity to activated platelets. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (1), 104-113 (2020).
