O modelo de sangramento de veia traseira refinada (TVT) em camundongos anestesiados é um método in vivo sensível para a avaliação do sangramento hemofílico. Este modelo de sangramento otimizado da TVT usa perda de sangue e tempo de sangramento como pontos finais, refinando outros modelos e evitando a morte como ponto final.
Modelos de sangramento de cauda são ferramentas importantes na pesquisa de hemofilia, especificamente para a avaliação de efeitos procoagulantes. O modelo de sobrevivência da veia traseira (TVT) tem sido preferido em muitas configurações devido à sensibilidade a doses clinicamente relevantes de FVIII, enquanto outros modelos estabelecidos, como o modelo de clipe de cauda, requerem níveis mais elevados de compostos procoagulantes. Para evitar o uso da sobrevivência como ponto final, desenvolvemos um modelo de TVT estabelecendo perda de sangue e tempo de sangramento como pontos finais e anestesia completa durante todo o experimento. Brevemente, camundongos anestesiados são posicionados com a cauda submersa em soro fisiológico temperado (37°C) e dosados com o composto de teste na veia lateral direita da cauda. Após 5 minutos, a veia lateral esquerda é transectada usando um guia de modelo, a cauda é devolvida ao soro fisiológico, e todos os episódios de sangramento são monitorados e registrados por 40 minutos durante a coleta do sangue. Se não ocorrer sangramento em 10 min, 20 min ou 30 min após a lesão, o coágulo é desafiado suavemente limpando o corte duas vezes com um cotonete de gaze molhada. Após 40 min, a perda de sangue é quantificada pela quantidade de hemoglobina sangrada no soro fisiológico. Este procedimento rápido e relativamente simples resulta em sangramentos consistentes e reprodutíveis. Em comparação com o modelo de sobrevivência da TVT, utiliza um procedimento mais humano sem comprometer a sensibilidade à intervenção farmacológica. Além disso, é possível utilizar ambos os sexos, reduzindo o número total de animais que precisam ser criados, em adesão aos princípios das 3R’s. Uma limitação potencial nos modelos sanguíneos é a natureza estocástica da hemostase, que pode reduzir a reprodutibilidade do modelo. Para combater isso, a interrupção manual do coágulo garante que o coágulo seja desafiado durante o monitoramento, impedindo que a hemostasia primária (plaqueta) pare de sangrar. Esta adição ao catálogo de modelos de lesão hemorrágida fornece uma opção para caracterizar efeitos procoagulantes de forma padronizada e humana.
Modelos animais são essenciais para compreender a patogênese da hemofilia e desenvolver e testar regimes e terapias de tratamento. O rato-nocaute Fator VIII (F8-KO) é um modelo amplamente utilizado para o estudo da hemofilia A 1,2. Esses camundongos recapitulam características-chave da doença e têm sido amplamente utilizados para o desenvolvimento de tratamentos, como produtos FVIII recombinantes 3,4,5 e estratégias de terapia genética 6,7.
Existem vários modelos de lesão hemorrágica para avaliar os efeitos farmacológicos de diferentes compostos hemostáticos in vivo. Um desses modelos de coagulação é o modelo de sobrevivência da transeção da veia traseira em camundongos 8,9,10,11,12,13,14, medindo a capacidade dos camundongos hemofílicos de sobreviver à exsanguinação após transeção de cauda. Este método foi introduzido há mais de quatro décadas, 15 e ainda é utilizado 9,16,17. No entanto, o modelo utiliza a sobrevivência como ponto final e requer observação dos animais durante um período de até 24 horas, durante o qual os animais estão conscientes e, portanto, podem sentir dor e angústia.
Modelos de sangramento de menor duração e sob anestesia total foram descritos anteriormente, como o modelo de clipe de cauda (também conhecido como ponta traseira)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . No entanto, para uma normalização completa da perda de sangue após o desafio de sangramento, esses modelos requerem doses de compostos procoagulantes (por exemplo, FVIII) muito superiores aos administrados clinicamente29. Um modelo diferente de lesão sob anestesia, o método de sangramento vena saphena, é sensível a doses mais baixas de compostos procoagulantes30, mas requer um alto nível de intervenção experimentadora, uma vez que os coágulos devem ser interrompidos com frequência (ao contrário de 3 vezes no modelo apresentado).
A padronização para um protocolo comum para testar novos compostos procoagulantes facilitaria muito a comparação de dados entre os laboratórios 31,32,33. Nos modelos tvt, ainda não há uma concordância comum sobre os pontos finais estudados (perda de sangue 7,26, tempo de sangramento 9,34 e taxa de sobrevivência35,36), e comprimento experimental varia entre os estudos13.
Nosso objetivo principal é descrever e caracterizar um modelo otimizado com alta reprodutibilidade, a possibilidade de estudar sob demanda, bem como um tratamento profilático, sensibilidade à intervenção farmacológica equivalente ao modelo de sobrevivência, mas não utilizando a morte ou quase-morte como pontos finais. Para reduzir a dor e a angústia, os animais não devem estar conscientes durante o sangramento e um ponto final mais ético precisa ser implementado37.
Os modelos de clipe de cauda são geralmente conduzidos em uma das duas variantes, ou amputando a ponta da cauda, por exemplo, amputação de 1-5 mm 18,19,20,21,23,24 ou, em uma variante mais grave, transeccionada a um diâmetro de cauda em torno de 1-3 mm 8,22,25 . Isso causa um sangramento arteriovenoso combinado, pois as veias laterais e dorsais e a artéria ventral são geralmente cortadas, e em geral, quanto maior a amputação, menor a sensibilidade a um composto procoagulante. Além disso, uma vez que a ponta da cauda é amputada, a lesão arteriovenosa é exposta sem qualquer tecido oposto; assim, pelo menos em teoria, é diferente dos sangramentos hemofílicos mais comuns.
Como o nome indica, apenas a veia é ferida em modelos de transeção da veia traseira, como descrito neste artigo, resultando em uma hemorragia exclusivamente venosa. Uma vez que o vaso não é totalmente cortado, espera-se que a lesão seja menor do que nos modelos de amputação, e o tecido ao redor do corte, que um coágulo pode aderir, é retido. Além disso, há pressão arterial mais baixa na veia em oposição à artéria. Esses fatores contribuem para um aumento da sensibilidade em relação aos modelos de amputação, de modo que a normalização do sangramento possa ser alcançada com doses clinicamente relevantes de terapia de reposição, por exemplo, com rFVIII em hemofilia A, o que é útil para avaliar a magnitude e durabilidade dos efeitos do tratamento procoagulante 26,38,39.
Este método otimizado de transeção de veias traseiras (TVT) tem várias vantagens em comparação com o método de sobrevivência da TVT. Os animais são totalmente anestesiados durante toda a duração do estudo, o que facilita o manuseio do rato e aumenta o bem-estar animal. Além disso, ao contrário do modelo de sobrevivência da TVT, a observação noturna não é necessária, e este modelo otimizado oferece a possibilidade de medir a perda de sangue e observar o tempo exato de sangramento acima de 40 minutos. Al…
The authors have nothing to disclose.
Esther Bloem e Thomas Nygaard são reconhecidos por apoio com medidas de FVIII no plasma. Bo Alsted é reconhecido por desenhar e usinar o modelo e cortar blocos.
#11 Scalpel blade | Swann-Morton | 503 | |
15 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One, Austria | 188271 | |
30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing | BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe | 320830 | |
Advate | Takeda, Japan | Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII) | |
Alcohol pads 70% ethanol | Hartmann, Soft-Zellin | 999 979 | |
Centrifuge | Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech | ||
Cutting template (Stainless steel) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm | |
Erythrocytes (RBC) lysing solution | Lysebio, ABX Diagnostics | 906012 | |
Gauze | |||
Haematological analyser | Sysmex | CT-2000iv | |
Heating lamp on stand | Phillips | IR250 | |
Heating pad with thermostat | CMA | model 150 | |
Hemoglobin standards and controls – 8.81 mmol / l batch dependent | HemoCue, Denmark | HemoCue calibrator, 707037 | Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH). |
Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box | Sigma Delta Dameca | ||
Isoflurane | Baxter | 26675-46-7 | |
Magnifier with lights | Eschenbach | ||
Measuring template (Aluminum) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm | |
Micropipettes + tips | Finnpipette | ||
Photometer | Molecular Devices Corporation, CA, USA | SpectraMax 340 photometer | |
Prism Software | GraphPad, San Diego, CA, USA | Version 9.0.1 | |
Saline 0.9% NaCl | Fresenius Kabi, Sweden | 883264 | |
Special tail marker block for TVT tail cut | |||
Tail holder | |||
Vacuum liquid suction | Vacusafe comfort, IBS | ||
Waterbath and thermostat | TYP 3/8 Julabo |