पूंछ नस ट्रांससेक्शन रक्तस्राव मॉडल पूरी तरह से संवेदनाहारी हीमोफिलिया एक चूहों में
Summary
संवेदनाहारी चूहों में परिष्कृत पूंछ शिरा ट्रांससेक्शन (टीवीटी) रक्तस्राव मॉडल हीमोफिलिक रक्तस्राव के आकलन के लिए विवो विधि में एक संवेदनशील है। यह अनुकूलित टीवीटी रक्तस्राव मॉडल समापन बिंदुओं के रूप में रक्त हानि और रक्तस्राव के समय का उपयोग करता है, अन्य मॉडलों को परिष्कृत करता है और समापन बिंदु के रूप में मृत्यु से बचता है।
Abstract
पूंछ रक्तस्राव मॉडल हीमोफीलिया अनुसंधान में महत्वपूर्ण उपकरण हैं, विशेष रूप से प्रोकोआगुलेंट प्रभावों के मूल्यांकन के लिए। पूंछ शिरा ट्रांससेक्शन (टीवीटी) उत्तरजीविता मॉडल को एफवीआईआईआई की नैदानिक रूप से प्रासंगिक खुराक के प्रति संवेदनशीलता के कारण कई सेटिंग्स में पसंद किया गया है, जबकि अन्य स्थापित मॉडल, जैसे कि पूंछ क्लिप मॉडल, को प्रोकोआगुलेंट यौगिकों के उच्च स्तर की आवश्यकता होती है। एक समापन बिंदु के रूप में अस्तित्व का उपयोग करने से बचने के लिए, हमने पूरे प्रयोग के दौरान समापन बिंदुओं और पूर्ण संज्ञाहरण के रूप में रक्त हानि और रक्तस्राव के समय की स्थापना करने वाला एक टीवीटी मॉडल विकसित किया। संक्षेप में, संवेदनाहारी चूहों को समशीतोष्ण खारा (37 डिग्री सेल्सियस) में डूबे पूंछ के साथ तैनात किया जाता है और सही पार्श्व पूंछ नस में परीक्षण यौगिक के साथ खुराक दी जाती है। 5 मिनट के बाद, बाएं पार्श्व पूंछ नस को टेम्पलेट गाइड का उपयोग करके ट्रांसेक्ट किया जाता है, पूंछ को खारा में वापस कर दिया जाता है, और रक्त एकत्र करते समय सभी रक्तस्राव एपिसोड की निगरानी की जाती है और 40 मिनट के लिए दर्ज की जाती है। यदि 10 मिनट, 20 मिनट, या 30 मिनट के बाद चोट पर कोई रक्तस्राव नहीं होता है, तो गीले धुंध झाड़ू के साथ दो बार कटौती को पोंछकर थक्के को धीरे-धीरे चुनौती दी जाती है। 40 मिनट के बाद, रक्त की हानि को खारा में हीमोग्लोबिन की मात्रा से निर्धारित किया जाता है। इस तेज़ और अपेक्षाकृत सरल प्रक्रिया के परिणामस्वरूप सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रक्तस्राव होता है। टीवीटी उत्तरजीविता मॉडल की तुलना में, यह औषधीय हस्तक्षेप के प्रति संवेदनशीलता से समझौता किए बिना अधिक मानवीय प्रक्रिया का उपयोग करता है। इसके अलावा, दोनों लिंगों का उपयोग करना संभव है, 3 आर के सिद्धांतों के पालन में, नस्ल की आवश्यकता वाले जानवरों की कुल संख्या को कम करना। रक्तस्राव मॉडल में एक संभावित सीमा हेमोस्टेसिस की स्टोकेस्टिक प्रकृति है, जो मॉडल की प्रजनन क्षमता को कम कर सकती है। इसका मुकाबला करने के लिए, मैनुअल थक्का व्यवधान यह सुनिश्चित करता है कि निगरानी के दौरान थक्के को चुनौती दी जाती है, प्राथमिक (प्लेटलेट) हेमोस्टेसिस को रक्तस्राव को रोकने से रोकता है। रक्तस्राव चोट मॉडल की सूची के लिए यह अतिरिक्त एक मानकीकृत और मानवीय तरीके से प्रोकोआगुलेंट प्रभावों को चिह्नित करने का विकल्प प्रदान करता है।
Introduction
हीमोफीलिया के रोगजनन को समझने और उपचार आहार और उपचार के विकास और परीक्षण के लिए पशु मॉडल आवश्यक हैं। फैक्टर आठवीं नॉक-आउट माउस (एफ 8-केओ) हीमोफीलिया ए 1,2 के अध्ययन के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला मॉडल है। ये चूहे रोग की प्रमुख विशेषताओं को दोहराते हैं और उपचार के विकास के लिए व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं, जैसे कि पुनः संयोजक एफवीआईआईआई उत्पाद 3,4,5 और जीन थेरेपी रणनीतियों 6,7।
विवो में विभिन्न हेमोस्टैटिक यौगिकों के औषधीय प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए विभिन्न रक्तस्राव चोट मॉडल हैं। इन जमावट मॉडलों में से एक चूहों 8,9,10,11,12,13,14 में पूंछ शिरा ट्रांससेक्शन उत्तरजीविता मॉडल है, जो पूंछ ट्रांससेक्शन के बाद एक्सेंगुइनेशन से बचने के लिए हीमोफिलिक चूहों की क्षमता को मापता है। यह विधि चार दशक पहले15 से अधिक समय पहले पेश की गई थी और अभी भी 9,16,17 का उपयोग किया जाता है। हालांकि, मॉडल एक समापन बिंदु के रूप में अस्तित्व का उपयोग करता है और 24 घंटे तक की अवधि में जानवरों के अवलोकन की आवश्यकता होती है, जिसके दौरान जानवर सचेत होते हैं और इसलिए दर्द और संकट का अनुभव कर सकते हैं।
छोटी अवधि और पूर्ण संज्ञाहरण के तहत रक्तस्राव मॉडल को पहले वर्णित किया गया है, जैसे कि पूंछ क्लिप मॉडल (जिसे पूंछ टिप के रूप में भी जाना जाता है) 8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . फिर भी, रक्तस्राव चुनौती के बाद रक्त हानि के पूर्ण सामान्यीकरण के लिए, इन मॉडलों को नैदानिक रूप से प्रशासित29 की तुलना में प्रोकोआगुलेंट यौगिकों (जैसे, एफवीआईआईआई) की खुराक की आवश्यकता होती है। संज्ञाहरण के तहत एक अलग चोट मॉडल, वेना सैफेना रक्तस्राव विधि, प्रोकोआगुलेंट यौगिकों30 की कम खुराक के प्रति संवेदनशील है, लेकिन उच्च स्तर के प्रयोगकर्ता हस्तक्षेप की आवश्यकता होती है क्योंकि थक्कों को अक्सर बाधित किया जाना चाहिए (प्रस्तुत मॉडल में 3 बार के विपरीत)।
नए प्रोकोआगुलेंट यौगिकों का परीक्षण करने के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल की दिशा में मानकीकरण प्रयोगशालाओं31,32,33 के बीच डेटा तुलना की सुविधा प्रदान करेगा। टीवीटी मॉडल में, अध्ययन किए गए समापन बिंदुओं (रक्त हानि 7,26, रक्तस्राव समय 9,34, और जीवित रहने की दर35,36) पर अभी तक एक आम समझौता नहीं है, और प्रयोगात्मक लंबाई अध्ययन 13 के बीच भिन्न होती है।
हमारा प्राथमिक उद्देश्य उच्च प्रजनन क्षमता के साथ एक अनुकूलित मॉडल का वर्णन और लक्षण वर्णन करना है, ऑन-डिमांड के साथ-साथ रोगनिरोधी उपचार का अध्ययन करने की संभावना, उत्तरजीविता मॉडल के बराबर औषधीय हस्तक्षेप के प्रति संवेदनशीलता, फिर भी समापन बिंदुओं के रूप में मृत्यु या निकट-मृत्यु का उपयोग नहीं करना है। दर्द और संकट को कम करने के लिए, जानवरों को रक्तस्राव के दौरान सचेत नहीं होना चाहिए और अधिक नैतिक समापन बिंदु को लागू करने की आवश्यकताहै।
टेल क्लिप मॉडल आम तौर पर दो वेरिएंट में से एक में आयोजित किए जाते हैं, या तो पूंछ की नोक को काटते हैं, उदाहरण के लिए, 1-5 मिमी 18,19,20,21,23,24 का विच्छेदन या, अधिक गंभीर संस्करण में, 1-3 मिमी 8,22,25 के आसपास पूंछ व्यास पर ट्रांसेक्ट किया जाता है . यह एक संयुक्त धमनी शिरापरक रक्तस्राव का कारण बनता है, क्योंकि पार्श्व और पृष्ठीय नसों और उदर धमनी आमतौर पर अलग हो जाते हैं, और सामान्य तौर पर, विच्छेदन जितना बड़ा होता है, प्रोकोआगुलेंट यौगिक की संवेदनशीलता उतनी ही कम होती है। इसके अलावा, चूंकि पूंछ की नोक को काट दिया जाता है, धमनीशिरापरक चोट बिना किसी विरोधी ऊतक के उजागर होती है; इस प्रकार, कम से कम सिद्धांत रूप में, यह सबसे आम हीमोफिलिक रक्तस्राव से भिन्न है।
जैसा कि नाम से पता चलता है, केवल शिरा पूंछ नस ट्रांससेक्शन मॉडल में घायल हो जाती है जैसे कि इस पत्र में वर्णित है, जिसके परिणामस्वरूप विशेष रूप से शिरापरक रक्तस्राव होता है। चूंकि पोत पूरी तरह से अलग नहीं है, इसलिए चोट विच्छेदन मॉडल की तुलना में छोटी होने की उम्मीद है, और कट के चारों ओर ऊतक, जो एक थक्का पालन कर सकता है, को बनाए रखा जाता है। इसके अलावा, धमनी के विपरीत नस में निम्न रक्तचाप होता है। ये कारक विच्छेदन मॉडल के सापेक्ष बढ़ी हुई संवेदनशीलता में योगदान करते हैं, जैसे कि रक्तस्राव का सामान्यीकरण प्रतिस्थापन चिकित्सा की नैदानिक रूप से प्रासंगिक खुराक के साथ प्राप्त किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, हीमोफिलिया ए में आरएफवीआईआईआई के साथ, जो प्रोकोआगुलेंट उपचार 26,38,39 केप्रभावों के परिमाण और स्थायित्व का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी है।
Protocol
Representative Results
Discussion
पूंछ नस ट्रांससेक्शन (टीवीटी) की इस अनुकूलित विधि में टीवीटी उत्तरजीविता विधि की तुलना में कई फायदे हैं। जानवरों को पूरे अध्ययन अवधि के लिए पूरी तरह से संवेदनाहारी किया जाता है, जो माउस हैंडलिंग को आसा?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एस्तेर ब्लोएम और थॉमस निगार्ड को प्लाज्मा में एफवीआईआईआई के माप के साथ समर्थन के लिए स्वीकार किया जाता है। बो अल्स्टेड को टेम्पलेट को ड्राइंग और मशीनिंग और कटिंग ब्लॉक के लिए स्वीकार किया जाता है।
Materials
| #11 Scalpel blade | Swann-Morton | 503 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One, Austria | 188271 | |
| 30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing | BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe | 320830 | |
| Advate | Takeda, Japan | Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII) | |
| Alcohol pads 70% ethanol | Hartmann, Soft-Zellin | 999 979 | |
| Centrifuge | Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech | ||
| Cutting template (Stainless steel) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm | |
| Erythrocytes (RBC) lysing solution | Lysebio, ABX Diagnostics | 906012 | |
| Gauze | |||
| Haematological analyser | Sysmex | CT-2000iv | |
| Heating lamp on stand | Phillips | IR250 | |
| Heating pad with thermostat | CMA | model 150 | |
| Hemoglobin standards and controls – 8.81 mmol / l batch dependent | HemoCue, Denmark | HemoCue calibrator, 707037 | Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH). |
| Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box | Sigma Delta Dameca | ||
| Isoflurane | Baxter | 26675-46-7 | |
| Magnifier with lights | Eschenbach | ||
| Measuring template (Aluminum) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm | |
| Micropipettes + tips | Finnpipette | ||
| Photometer | Molecular Devices Corporation, CA, USA | SpectraMax 340 photometer | |
| Prism Software | GraphPad, San Diego, CA, USA | Version 9.0.1 | |
| Saline 0.9% NaCl | Fresenius Kabi, Sweden | 883264 | |
| Special tail marker block for TVT tail cut | |||
| Tail holder | |||
| Vacuum liquid suction | Vacusafe comfort, IBS | ||
| Waterbath and thermostat | TYP 3/8 Julabo |
References
- Bi, L., et al. Targeted disruption of the mouse factor VIII gene produces a model of haemophilia A. Nature Genetics. 10 (1), 119-121 (1995).
- Bi, L., et al. Further characterization of factor VIII-deficient mice created by gene targeting: RNA and protein studies. Blood. 88 (9), 3446-3450 (1996).
- Stennicke, H. R., et al. A novel B-domain O-glycoPEGylated FVIII (N8-GP) demonstrates full efficacy and prolonged effect in hemophilic mice models. Blood. 121 (11), 2108-2116 (2013).
- Shapiro, A. D. Anti-hemophilic factor (recombinant), plasma/albumin-free method (octocog-alpha; ADVATE) in the management of hemophilia A. Vascular Health and Risk Management. 3 (5), 555-565 (2007).
- Recht, M., et al. Clinical evaluation of moroctocog alfa (AF-CC), a new generation of B-domain deleted recombinant factor VIII (BDDrFVIII) for treatment of haemophilia A: demonstration of safety, efficacy, and pharmacokinetic equivalence to full-length recombinant factor VIII. Haemophilia. 15 (4), 869-880 (2009).
- Miao, C. H., et al. CD4+FOXP3+ regulatory T cells confer long-term regulation of factor VIII-specific immune responses in plasmid-mediated gene therapy-treated hemophilia mice. Blood. 114 (19), 4034-4044 (2009).
- Milanov, P., et al. Engineered factor IX variants bypass FVIII and correct hemophilia A phenotype in mice. Blood. 119 (2), 602-611 (2012).
- Dumont, J. A., et al. Prolonged activity of a recombinant factor VIII-Fc fusion protein in hemophilia A mice and dogs. Blood. 119 (13), 3024-3030 (2012).
- Pan, J., et al. Enhanced efficacy of recombinant FVIII in noncovalent complex with PEGylated liposome in hemophilia A mice. Blood. 114 (13), 2802-2811 (2009).
- Liu, T., et al. Improved coagulation in bleeding disorders by Non-Anticoagulant Sulfated Polysaccharides (NASP). Journal of Thrombosis and Haemostasis. 95 (1), 68-76 (2006).
- Brooks, A. R., et al. Glycoengineered factor IX variants with improved pharmacokinetics and subcutaneous efficacy. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (9), 1699-1706 (2013).
- Baru, M., et al. Factor VIII efficient and specific non-covalent binding to PEGylated liposomes enables prolongation of its circulation time and haemostatic efficacy. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 93 (6), 1061-1068 (2005).
- Molina, E. S., Fujita, A., Sogayar, M. C., Demasi, M. A. A quantitative and humane tail bleeding assay for efficacy evaluation of antihaemophilic factors in haemophilia A mice. Haemophilia. 20 (6), 392-398 (2014).
- Broze, G. J., Yin, Z. F., Lasky, N. A tail vein bleeding time model and delayed bleeding in hemophiliac mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 85 (4), 747-748 (2001).
- Dejana, E., Callioni, A., Quintana, A., de Gaetano, G. Bleeding time in laboratory animals. II – A comparison of different assay conditions in rats. Thrombosis Research. 15 (1-2), 191-197 (1979).
- Girard, T. J., Lasky, N. M., Grunz, K., Broze, G. J. Suppressing protein Z-dependent inhibition of factor Xa improves coagulation in hemophilia A. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (1), 149-156 (2019).
- Zhang, J. P., et al. Curing hemophilia A by NHEJ-mediated ectopic F8 insertion in the mouse. Genome Biology. 20 (1), 276 (2019).
- Sambrano, G. R., Weiss, E. J., Zheng, Y. W., Huang, W., Coughlin, S. R. Role of thrombin signalling in platelets in haemostasis and thrombosis. Nature. 413 (6851), 74-78 (2001).
- Tranholm, M., et al. Improved hemostasis with superactive analogs of factor VIIa in a mouse model of hemophilia A. Blood. 102 (10), 3615-3620 (2003).
- Mei, B., et al. Rational design of a fully active, long-acting PEGylated factor VIII for hemophilia A treatment. Blood. 116 (2), 270-279 (2010).
- Karpf, D. M., et al. Prolonged half-life of glycoPEGylated rFVIIa variants compared to native rFVIIa. Thrombosis Research. 128 (2), 191-195 (2011).
- Ivanciu, L., et al. A zymogen-like factor Xa variant corrects the coagulation defect in hemophilia. Nature Biotechnology. 29 (11), 1028-1033 (2011).
- Ostergaard, H., et al. Prolonged half-life and preserved enzymatic properties of factor IX selectively PEGylated on native N-glycans in the activation peptide. Blood. 118 (8), 2333-2341 (2011).
- Maroney, S. A., et al. Absence of hematopoietic tissue factor pathway inhibitor mitigates bleeding in mice with hemophilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3927-3931 (2012).
- Holmberg, H. L., Lauritzen, B., Tranholm, M., Ezban, M. Faster onset of effect and greater efficacy of NN1731 compared with rFVIIa, aPCC and FVIII in tail bleeding in hemophilic mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 7 (9), 1517-1522 (2009).
- Johansen, P. B., Tranholm, M., Haaning, J., Knudsen, T. Development of a tail vein transection bleeding model in fully anaesthetized haemophilia A mice – characterization of two novel FVIII molecules. Haemophilia. 22 (4), 625-631 (2016).
- Ferrière, S., et al. A hemophilia A mouse model for the in vivo assessment of emicizumab function. Blood. 136 (6), 740-748 (2020).
- Elm, T., et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of a new recombinant FVIII (N8) in haemophilia A mice. Haemophilia. 18 (1), 139-145 (2012).
- Björkman, S. Prophylactic dosing of factor VIII and factor IX from a clinical pharmacokinetic perspective. Haemophilia. 9, 101-108 (2003).
- Pastoft, A. E., et al. A sensitive venous bleeding model in haemophilia A mice: effects of two recombinant FVIII products (N8 and Advate). Haemophilia. 18 (5), 782-788 (2012).
- Saito, M. S., et al. New approaches in tail-bleeding assay in mice: improving an important method for designing new anti-thrombotic agents. International Journal of Experimental Pathology. 97 (3), 285-292 (2016).
- Liu, Y., Jennings, N. L., Dart, A. M., Du, X. J. Standardizing a simpler, more sensitive and accurate tail bleeding assay in mice. World Journal of Experimental Medicine. 2 (2), 30-36 (2012).
- Greene, T. K., et al. Towards a standardization of the murine tail bleeding model. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (12), 2820-2822 (2010).
- Cerullo, V., et al. Correction of murine hemophilia A and immunological differences of factor VIII variants delivered by helper-dependent adenoviral vectors. Molecular Therapy. 15 (12), 2080-2087 (2007).
- Shi, Q., et al. Factor VIII ectopically targeted to platelets is therapeutic in hemophilia A with high-titer inhibitory antibodies. Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1974-1982 (2006).
- Parker, E. T., Lollar, P. A quantitative measure of the efficacy of factor VIII in hemophilia A mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 89 (3), 480-485 (2003).
- Stokes, W. S. Reducing Unrelieved Pain and Distress in Laboratory Animals Using Humane Endpoints. ILAR Journal. 41 (2), 59-61 (2000).
- Stagaard, R., et al. Abrogating fibrinolysis does not improve bleeding or rFVIIa/rFVIII treatment in a non-mucosal venous injury model in haemophilic rodents. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (7), 1369-1382 (2018).
- Stagaard, R., et al. Absence of functional compensation between coagulation factor VIII and plasminogen in double-knockout mice. Blood Advances. 2 (22), 3126-3136 (2018).
- Bolton-Maggs, P. H., Pasi, K. J. Haemophilias A and B. Lancet. 361 (9371), 1801-1809 (2003).
- Lloyd Jones, M., Wight, J., Paisley, S., Knight, C. Control of bleeding in patients with haemophilia A with inhibitors: a systematic review. Haemophilia. 9 (4), 464-520 (2003).
- Sixma, J. J., vanden Berg, A. The haemostatic plug in haemophilia A: a morphological study of haemostatic plug formation in bleeding time skin wounds of patients with severe haemophilia A. British Journal of Haematology. 58 (4), 741-753 (1984).
- Proulle, V., et al. Recombinant activated factor VII-induced correction of bleeding tendency in genetically engineered von Willebrand disease type 2B mice evaluated using new tail transection bleeding models. International Society on Thrombosis and Haemostasis Congress. , (2017).
- Rode, F., et al. Preclinical pharmacokinetics and biodistribution of subcutaneously administered glycoPEGylated recombinant factor VIII (N8-GP) and development of a human pharmacokinetic prediction model. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (6), 1141-1152 (2018).
- Holmberg, H., et al. GlycoPEGylated rFVIIa (N7-GP) has a prolonged hemostatic effect in hemophilic mice compared with rFVIIa. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (5), 1070-1072 (2011).
- Kawecki, C., et al. Posters Abstracts – Thrombin-mediated Activation of Factor VIII is Insufficient to Produce All Necessary Cofactor Activity in vivo. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 3, 1 (2019).
- Johansen, P., et al. In vivo effect of recombinant FVIIA (NOVOSEVEN®) and RFIX in a refined tail vein transection bleeding model in mice with haemophilia A and B: PO147-MON. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13, (2015).
- Enoksson, M., et al. Enhanced potency of recombinant factor VIIa with increased affinity to activated platelets. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (1), 104-113 (2020).
