मानव प्राथमिक त्वचा फाइब्रोब्लास्ट के आधार पर हंटिंगटन के रोग मॉडल में माइक्रोट्यूबुल प्लस-एंड डायनेमिक्स विज़ुअलाइज़ेशन
Summary
यह प्रोटोकॉल प्राथमिक सेल संस्कृति में उनके गतिशील गुणों का अध्ययन करने के लिए ईबी 3 प्रोटीन ट्रांसफैक्शन द्वारा माइक्रोट्यूबुल प्लस-एंड विज़ुअलाइज़ेशन को समर्पित है। यह प्रोटोकॉल हंटिंगटन के रोग रोगियों से प्राप्त मानव प्राथमिक त्वचा फाइब्रोब्लास्ट पर लागू किया गया था ।
Abstract
समय-चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन में रुचि के फ्लोरोसेंटली लेबल मार्कर प्रोटीन के साथ ट्रांसफैक्शन साइटोस्केलेटन के गतिशील गुणों का अध्ययन करने की एक क्लासिक विधि है। यह प्रोटोकॉल मानव प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट ट्रांसफैक्शन के लिए एक तकनीक प्रदान करता है, जो प्राथमिक कोशिका खेती की स्थिति की बारीकियों के कारण मुश्किल हो सकता है। इसके अतिरिक्त, साइटोस्केलेटन गतिशील संपत्ति रखरखाव को माइक्रोट्यूबुल स्थिरीकरण के कारण बिना एक अच्छा सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्राप्त करने के लिए ट्रांसफैक्शन के निम्न स्तर की आवश्यकता होती है। कोशिकाओं को प्रकाश-प्रेरित तनाव और फ्लोरोसेंट डाई लुप्त होती से बचाने के उपाय करना महत्वपूर्ण है। हमारे काम के दौरान, हमने मानव प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट अध्ययन के लिए उपयुक्त स्थितियों के सर्वोत्तम संयोजन का चयन करने के लिए विभिन्न ट्रांसफैक्शन विधियों और प्रोटोकॉल के साथ-साथ विभिन्न वैक्टर का परीक्षण किया। हमने इमेजजे का उपयोग करके परिणामी समय-चूक वीडियो का विश्लेषण किया और माइक्रोट्यूबुल गतिशीलता की गणना की। विभिन्न सेल भागों में माइक्रोट्यूबुल्स के प्लस-सिरों की गतिशीलता समान नहीं है, इसलिए हमने विश्लेषण को उपसमूहों में विभाजित किया – सेंट्रोसोम क्षेत्र, लामेला, और फाइब्रोब्लास्ट की पूंछ। विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल का उपयोग रोगी नमूनों में साइटोस्केलेटन गतिशीलता के इन विट्रो विश्लेषण के लिए किया जा सकता है, जिससे विभिन्न रोग विकास की गतिशीलता को समझने की दिशा में अगला कदम उठाया जा सकता है।
Introduction
हंटिंगटन रोग (एचडी) जीन एन्कोडिंगहंटिंगटिन प्रोटीन (एचटीटी) में म्यूटेशन के कारण एक लाइलाज न्यूरोडीजेनेरेटिव विकृति है। एचटीटी मुख्य रूप से वेसिकल्स और माइक्रोट्यूबुल्स से जुड़ा हुआ है और शायद माइक्रोट्यूबुल पर निर्भर परिवहन प्रक्रियाओं1,2में शामिल है। माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता पर उत्परिवर्ती एचटीटी के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, हमने ईबी 3 प्रोटीन के विट्रो विज़ुअलाइज़ेशन का उपयोग किया, जो बढ़ते प्लस-एंड्स को बाध्यकारी और स्थिर करके माइक्रोट्यूबल के गतिशील गुणों को नियंत्रित करता है। फ्लोरोसेंटी लेबल EB3 को मानव त्वचा फाइब्रोब्लास्ट में लोड करने के लिए, प्लाज्मिड ट्रांसफैक्शन लागू किया गया था। हमने इस अध्ययन के लिए एचडी रोगियों की त्वचा बायोप्सी से प्राप्त प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट संस्कृति का उपयोग किया।
एचटीटी प्रोटीन जीन में उत्परिवर्तन से पॉलीग्लूटामाइन ट्रैक्ट 3 का विस्तारहोताहै । एचटीटी की ऐसी सेलुलर प्रक्रियाओं में भूमिका है जैसे एंडोसाइटोसिस4,सेल ट्रांसपोर्ट1,2,प्रोटीन क्षुण्णता5,आदि। इन प्रक्रियाओं के पर्याप्त हिस्से में माइक्रोट्यूबल सहित सेल साइटोस्केलेटन के विभिन्न तत्व शामिल हैं।
मानव प्राथमिक कोशिकाओं के रूप में बारीकी से संभव के रूप में रोगी कोशिकाओं में होने वाली घटनाओं को पुन: पेश करने के लिए सबसे अच्छा मॉडल हैं । इस तरह के मॉडल बनाने के लिए, किसी को मानव बायोप्सी सामग्री (उदाहरण के लिए, सर्जिकल नमूनों से) से कोशिकाओं को अलग करने की आवश्यकता है। परिणामस्वरूप प्राथमिक कोशिका रेखा विभिन्न आनुवंशिक, जैव रासायनिक, आणविक, और सेल जीव विज्ञान विधियों का उपयोग कर रोगजनन का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है। इसके अलावा, मानव प्राथमिक कोशिका संस्कृतियां विभिन्न ट्रांसफरेंट और ट्रांसजेनिक संस्कृतियों को बनाने के लिए एक अग्रदूत के रूप में काम करती हैं6।
हालांकि, अमर कोशिका संस्कृतियों के विपरीत, प्राथमिक कोशिकाओं का महत्वपूर्ण नुकसान उनकी सीमित मार्ग क्षमता है। इसलिए, हम प्रारंभिक मार्ग चरण (15 तक) में कोशिकाओं का उपयोग करने की सलाह देते हैं। पुरानी संस्कृतियां बहुत जल्दी पतित होती हैं, जिससे उनके अद्वितीय गुण ों का नुकसान होता है। इस प्रकार, नई प्राप्त प्राथमिक कोशिकाओं को दीर्घकालिक भंडारण के लिए जमे हुए रखा जाना चाहिए।
प्राथमिक कोशिका संस्कृतियां खेती की स्थिति के लिए अतिसंवेदनशील होती हैं। इसलिए, उन्हें अक्सर बढ़ती स्थितियों के अद्वितीय दृष्टिकोण और अनुकूलन की आवश्यकता होती है। विशेष रूप से, हमारे प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले मानव त्वचा प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट सब्सट्रेट पर मांग कर रहे हैं। इसलिए, हमने प्रयोग प्रकार के आधार पर विभिन्न अतिरिक्त कोटिंग्स (जैसे, जिलेटिन या फाइब्रोनेक्टिन) का उपयोग किया।
सेल साइटोस्केलेटन सेल आकार, गतिशीलता और लोकोमोशन निर्धारित करता है। साइटोस्केलेटन की गतिशीलता इंटरफेज और माइटोसिस दोनों में कई इंट्रासेलुलर प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण है। विशेष रूप से, ट्यूबुलिन से पॉलीमराइज्ड साइटोस्केलेटन अत्यधिक गतिशील और ध्रुवीय संरचनाएं हैं, जो मोटर प्रोटीन-मध्यस्थता निर्देशित इंट्रासेलुलर परिवहन को सक्षम करती हैं। माइक्रोट्यूबुल्स के सिरों को निरंतर पुनर्व्यवस्था में रखा जाता है, उनके विधानसभा चरण अलग-अलग चरणों के साथ वैकल्पिक होते हैं, और इस व्यवहार को “गतिशील अस्थिरता”7,8, 9कहाजाताहै। विभिन्न संबद्ध प्रोटीन बहुलीकरण प्रतिक्रिया के संतुलन को स्थानांतरित करते हैं, जिससे या तो बहुलक गठन या प्रोटीन मोनोमर गठन होता है। ट्यूबलिन सबयूनिट का जोड़ मुख्य रूप से माइक्रोट्यूबुल्स10के प्लस-एंड पर होता है। अंत बाध्यकारी (ईबी) प्रोटीन परिवार में तीन सदस्य होते हैं: EB1, EB2, और EB3। वे प्लस-एंड-ट्रैकिंग प्रोटीन (+ टीआईपी) के रूप में काम करते हैं और माइक्रोट्यूबल्स के गतिशील गुणों को बाध्यकारी और उनके बढ़ते प्लस-एंड्स11को स्थिर करके विनियमित करते हैं।
कई अध्ययनों में फ्लोरोसेंट अणु-लेबल ट्यूबुलिन माइक्रोइंजेक्शन या टाइम-लैप्स इमेजिंग और वीडियो विश्लेषण के साथ ट्रांसफैक्शन का उपयोग किया जाता है ताकि विट्रो मेंमाइक्रोट्यूबुल्स की कल्पना की जा सके। ये विधियां आक्रामक और कोशिकाओं, विशेष रूप से प्राथमिक मानव कोशिकाओं के लिए हानिकारक हो सकती हैं। सबसे चुनौतीपूर्ण कदम सेल ट्रांसफैक्शन के लिए शर्तों को ढूंढना है। हमने व्यवहार्यता और देशी सेल आकृति विज्ञान को प्रभावित किए बिना ट्रांसफैक्शन के उच्चतम संभव स्तर तक पहुंचने की कोशिश की। यह अध्ययन स्वस्थ दाताओं और हंटिंगटन रोग के रोगियों की त्वचा फाइब्रोब्लास्ट में माइक्रोट्यूबुल गतिशीलता में अंतर का अध्ययन करने के लिए शास्त्रीय विधि लागू करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
माइक्रोट्यूबुल्स की गतिशीलता विश्लेषण के लिए बेहतर गुणवत्ता परिणाम उच्च गुणवत्ता वाले सूक्ष्म छवियों से प्राप्त किए जा सकते हैं। जीवित कोशिकाओं के समय-चूक इमेजिंग के लिए सभी आवश्यक शर्तों का पालन क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को रूसी संघ के विज्ञान और उच्च शिक्षा मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित किया गया था, अनुदान संख्या 075-15-2019-1669 (फाइब्रोब्लास्ट का ट्रांसफेक्शन), रूसी विज्ञान फाउंडेशन द्वारा, अनुदान संख्या 19-15-00425 (विट्रो मेंफाइब्रोब्लास्ट की खेती पर अन्य सभी कार्य) द्वारा। यह आंशिक रूप से Lomonosov मास्को राज्य विश्वविद्यालय विकास कार्यक्रम PNR5.13 (इमेजिंग और विश्लेषण) द्वारा समर्थित था । लेखक ों ने ए एन बेलोजरस्की इंस्टीट्यूट ऑफ फिजियो-केमिकल बायोलॉजी में निकॉन सेंटर ऑफ एक्सीलेंस के समर्थन को स्वीकार किया । हम आवाज अभिनय के साथ उसकी मदद सहायता के लिए एकातेरिना तरण के लिए हमारे विशेष धन्यवाद की पेशकश करना चाहते हैं । लेखक भी वीडियो संपादन के साथ उनकी मदद के लिए पावेल बेलिकोव का शुक्रिया अदा करते हैं । पांडुलिपि में आंकड़े BioRender.com के साथ बनाए गए थे।
Materials
| Instrumentation | |||
| Camera iXon DU897 EMCCD | Andor Technology | ||
| Eppendorf Centrifuge 5804 R | Eppendorf Corporate | ||
| Fluorescence filter set HYQ FITC | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| LUNA-II Automated Cell Counte | Logos Biosystems | L40002 | |
| Microscope incubator for lifetime filming | Okolab | Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS | |
| Gas controller CO2-O2-UNIT-BL | |||
| Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13) | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Software | |||
| Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c) | Open source image processing software | ||
| NIS Elements | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Additional reagents | |||
| Mineral oil (Light white oil) | MP | 151694 | |
| Cell culture dish | |||
| Cell Culture Dish | SPL Lifesciences | 20035 | |
| Confocal Dish (glass thickness 170 µm) | SPL Lifesciences | 211350 | Alternative: MatTek |
| Conical Centrifuge tube | SPL Lifesciences | 50015 | |
| Cryogenic Vials | Corning-Costar | 430659 | |
| Microcentrifuge Tube | Nest | 615001 | |
| Cultivation | |||
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Dimethyl sulfoxide | PanEko |  135 |
|
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | PanEko | C420 |
|
| DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution) | PanEko | P060 |
|
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | K053/SH30071.03 | |
| Gelatin (bovine skin) | PanEko | 070 |
|
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Opti-MEM (1x) + Glutamax | Gibco | 519850026 | |
| Penicillin-streptomycin | PanEko | A063 |
|
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| Transfection | |||
| Plasmid DNA with EB3-GFP | Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam] |
Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003 |
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