인간 1차 피부 섬유아세포를 기반으로 한 헌팅턴 병 모델의 마이크로튜블러 플러스 엔드 다이내믹스 시각화
Summary
이 프로토콜은 EB3 단백질 트랜스퍼션에 의한 마이크로튜블러 플러스 엔드 시각화에 전념하여 1차 세포 배양에서 그들의 역동적인 특성을 연구합니다. 이 프로토콜은 헌팅턴병 환자로부터 얻은 인간 1차 피부 섬유아세포에 구현되었다.
Abstract
시간 경과 비디오 현미경 검사법과 함께 관심의 형광 표지 마커 단백질과 함께 경질은 세포 골격의 동적 특성을 연구하는 고전적인 방법입니다. 이 프로토콜은 1 차적인 세포 경작 조건의 세부 사항 때문에 어려울 수 있는 인간 1 차섬유아 성 전염을 위한 기술을 제안합니다. 또한, 사이토스켈레톤 동적 특성 유지 보수는 미세투알 안정화를 일으키지 않고 좋은 신호 대 잡음 비율을 얻기 위해 낮은 수준의 트랜스페트가 필요합니다. 빛으로 인한 스트레스와 형광염 변색으로부터 세포를 보호하기 위한 조치를 취하는 것이 중요합니다. 우리의 일의 과정에서, 우리는 인간 적인 1 차적인 섬유아세포 연구 결과에 적합한 조건의 제일 조합을 선택하기 위하여 다른 transfection 방법 및 프로토콜 및 다른 벡터를 시험했습니다. ImageJ를 사용하여 결과 시간 경과 비디오와 계산된 마이크로튜뮬 역학을 분석했습니다. 다른 세포 부분에서 microtubules의 플러스 끝의 역학은 유사하지 않습니다, 그래서 우리는 하위 그룹으로 분석을 분할 – 중심 영역, 라멜라, 섬유 아세포의 꼬리. 특히, 이 프로토콜은 환자 샘플에서 세포 골격 역학의 체외 분석에 사용할 수 있으며, 다양한 질병 개발의 역학을 이해하는 다음 단계를 가능하게 합니다.
Introduction
헌팅턴병(헌팅턴병)은 돌연변이 유전자 인코딩헌팅틴 단백질(HTT)에 의한 난치성 신경퇴행성 병리학이다. HTT는 주로 소포 및 마이크로 투튜브와 관련이 있으며 아마도 마이크로 튜블러 의존 운송 프로세스1,2에 관여할 수있습니다. 미세 수염 역학에 돌연변이 HTT의 영향을 연구하기 위해, 우리는 결합하고 성장하는 플러스 엔드를 안정화하여 마이크로 투비의 동적 특성을 조절하는 EB3 단백질의 체외 시각화를 사용했습니다. 형광으로 표시된 EB3를 인간 피부 섬유아세포에 적재하기 위해 플라스미드 트랜스펙션이 적용되었습니다. 우리는 이 연구를 위해 헌턴타곤 환자의 피부 생검에서 얻은 1차 섬유아세포 배양을 사용했습니다.
HTT 단백질 유전자의 돌연변이는 폴리글루타민 관3의신장으로 이어집니다. HTT는 내분비성4,세포 수송1,2,단백질 분해5등과 같은 세포 공정에 중요한 역할을 한다. 이러한 프로세스의 상당 부분은 마이크로 투튜플을 포함한 세포 세포 골격의 다양한 요소를 포함한다.
인간 1 차 세포는 가능한 한 밀접하게 환자 세포에서 발생하는 이벤트를 재현하는 가장 좋은 모델입니다. 이러한 모델을 만들려면 인간 생검 물질 (예 : 수술 샘플에서)에서 세포를 분리해야합니다. 결과 1 차 세포주 다양 한 유전, 생 화학, 분자 및 세포 생물학 방법을 사용 하 여 병 인 발생을 공부 하기 에 적합. 또한, 인간 1차 세포 배양은 다양한 환분화 및 형질전환배양6을만들기 위한 선구자역할을 한다.
그러나, 불멸의 세포 배양과는 대조적으로, 1 차 세포의 중요한 단점은 그들의 제한된 통로 수용량입니다. 따라서 초기 통로 단계(최대 15개)에서 셀을 사용하는 것이 좋습니다. 오래된 문화권은 매우 빠르게 퇴화하여 고유한 특성을 잃게 됩니다. 따라서, 새로 얻은 1차 세포는 장기 저장을 위해 동결된 유지되어야 한다.
1 차적인 세포 배양은 재배 조건에 영향을 받기 쉽습니다. 따라서 종종 고유한 접근 방식과 증가하는 조건의 최적화가 필요합니다. 특히, 우리의 실험에 사용되는 인간의 피부 기본 섬유 아세포는 기판에 요구하고있다. 따라서 실험 유형에 따라 다양한 코팅(예: 젤라틴 또는 섬유네틴)을 사용했습니다.
세포 세포 골격은 세포 모양, 이동성 및 운동을 결정합니다. 세포 골격의 역학은 상호 및 미토시스 모두에서 많은 세포 내 과정에 매우 중요합니다. 특히, 튜룰린에서 중합된 사이토스켈레톤은 매우 역동적이고 극성 구조로, 모터 단백질 매개 방향 세포 내 수송을 가능하게 한다. 마이크로튜블의 끝은 일정한 재배열에 있으며, 조립 단계는 분해 단계와 번갈아 가며,이 동작을 “동적불안정성”7,8,9라고합니다. 다양한 관련 단백질은 중합체 형성 또는 단백질 단량체 형성으로 이어지는 중합 반응의 평형을 이동시킵니다. 튜룰린 서브유닛의 첨가는 주로마이크로튜블(10)의플러스 엔드에서 발생한다. 최종 결합 (EB) 단백질 가족은 EB1, EB2 및 EB3의 세 가지 구성원으로 구성됩니다. 그들은 플러스 엔드 추적 단백질 (+TIP)의 역할을하고 결합하고 성장하는 플러스 엔드11을안정화하여 마이크로 튜버의 동적 특성을 조절합니다.
많은 연구는 형광 분자 표지 튜룰린 미세 주입 또는 시간 경과 이미징 및 비디오 분석을 사용하여 체외에서마이크로 투튜브를 시각화합니다. 이 방법은 세포, 특히 1 차적인 인간 세포에 침략적이고 유해할 지도 모릅니다. 가장 어려운 단계는 세포 형질 전환에 대한 조건을 찾는 것입니다. 우리는 생존력과 네이티브 세포 형태에 영향을 미치지 않고 가능한 한 높은 수준의 트랜스페션에 도달하려고 노력했습니다. 이 연구는 헌팅턴병을 앓고 있는 건강한 기증자와 환자의 피부 섬유아세포에 있는 microtubule 역학에 있는 다름을 연구하기 위하여 고전적인 방법을 적용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
마이크로튜블러의 역학 분석을 위한 더 나은 품질 결과는 고품질 현미경 심상에서 얻을 수 있습니다. 살아있는 세포의 시간 경과 화상 진찰을 위해 필요한 모든 조건을 관찰하고 화상 진찰 매개변수를 정확하게 조정하는 것이 중요합니다. 유리는 플라스틱보다 빛의 다른 굴절 인덱스를 가지고 있기 때문에 유리 바닥 (공초점 요리)와 특수 세포 배양 접시를 사용하는 것이 중요합니다. 이러한 매개…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 러시아 연방 과학 고등 교육부에 의해 투자되었다, 러시아 과학 재단에 의해 제 075-15-2019-1669 호 (섬유 아세포의 변환) 부여, 19-15-00425 호 (체외에서섬유 아세포 재배에 다른 모든 작품). 그것은 부분적으로 로모노소프 모스크바 주립 대학 개발 프로그램 PNR5.13 (이미징 및 분석)에 의해 지원되었다. 저자는 물리 시코 화학 생물학의 A. N. 벨로체르스키 연구소에서 우수성의 니콘 센터의 지원을 인정합니다. 우리는 음성 연기에 대한 그녀의 도움에 대한 에카테리나 타란에게 특별한 감사를 제공하고 싶습니다. 저자는 또한 비디오 편집에 대한 그의 도움에 대한 파벨 벨리코프에게 감사드립니다. 원고의 수치는 BioRender.com 함께 만들어졌습니다.
Materials
| Instrumentation | |||
| Camera iXon DU897 EMCCD | Andor Technology | ||
| Eppendorf Centrifuge 5804 R | Eppendorf Corporate | ||
| Fluorescence filter set HYQ FITC | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| LUNA-II Automated Cell Counte | Logos Biosystems | L40002 | |
| Microscope incubator for lifetime filming | Okolab | Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS | |
| Gas controller CO2-O2-UNIT-BL | |||
| Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13) | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Software | |||
| Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c) | Open source image processing software | ||
| NIS Elements | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Additional reagents | |||
| Mineral oil (Light white oil) | MP | 151694 | |
| Cell culture dish | |||
| Cell Culture Dish | SPL Lifesciences | 20035 | |
| Confocal Dish (glass thickness 170 µm) | SPL Lifesciences | 211350 | Alternative: MatTek |
| Conical Centrifuge tube | SPL Lifesciences | 50015 | |
| Cryogenic Vials | Corning-Costar | 430659 | |
| Microcentrifuge Tube | Nest | 615001 | |
| Cultivation | |||
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Dimethyl sulfoxide | PanEko |  135 |
|
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | PanEko | C420 |
|
| DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution) | PanEko | P060 |
|
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | K053/SH30071.03 | |
| Gelatin (bovine skin) | PanEko | 070 |
|
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Opti-MEM (1x) + Glutamax | Gibco | 519850026 | |
| Penicillin-streptomycin | PanEko | A063 |
|
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| Transfection | |||
| Plasmid DNA with EB3-GFP | Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam] |
Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003 |
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