Визуализация динамики микротрубочек Plus-End в модели болезни Гентингтона на основе первичных фибробластов кожи человека
Summary
Этот протокол предназначен для визуализации микротрубочек плюс конец путем трансфекции белка EB3 для изучения их динамических свойств в первичной клеточной культуре. Протокол был реализован на первичных фибробластах кожи человека, полученных от пациентов с болезнью Гентингтона.
Abstract
Трансфекция флуоресцентно меченым маркерным белком, представляющим интерес, в сочетании с покадровой видеомикроскопией является классическим методом изучения динамических свойств цитоскелета. Этот протокол предлагает технику первичной трансфекции фибробластов человека, которая может быть затруднена из-за специфики условий культивирования первичных клеток. Кроме того, поддержание динамических свойств цитоскелета требует низкого уровня трансфекции для получения хорошего отношения сигнал/шум, не вызывая стабилизации микротрубочек. Важно принять меры по защите клеток от светового стресса и флуоресцентного затухания красителей. В ходе нашей работы мы протестировали различные методы и протоколы трансфекции, а также различные векторы, чтобы выбрать наилучшую комбинацию условий, подходящих для исследований первичных фибробластов на людях. Мы проанализировали полученные покадровые видео и рассчитали динамику микротрубочек с помощью ImageJ. Динамика плюсов микротрубочек в разных частях клеток не одинакова, поэтому мы разделили анализ на подгруппы — центросомную область, пластинку и хвост фибробластов. Примечательно, что этот протокол может быть использован для анализа in vitro динамики цитоскелетов в образцах пациентов, что позволяет сделать следующий шаг к пониманию динамики развития различных заболеваний.
Introduction
Болезнь Гентингтона (БГ) является неизлечимой нейродегенеративной патологией, вызванной геном мутации, кодирующим белок хунтингтина (HTT). HTT в первую очередь связан с везикулами и микротрубочками и, вероятно, участвует в микротрубочезависимых транспортных процессах1,2. Для изучения влияния мутантного HTT на динамику микротрубочек мы использовали визуализацию in vitro белка EB3, который регулирует динамические свойства микротрубочек путем связывания и стабилизации растущих плюсов. Для загрузки флуоресцентно меченого EB3 в фибробласты кожи человека применяли плазмидную трансфекцию. Для этого исследования мы использовали первичную культуру фибробластов, полученную из биопсии кожи пациентов с БГ.
Мутация в гене белка HTT приводит к удлинению полиглутаминового тракта3. HTT играет роль в таких клеточных процессах, как эндоцитоз4,клеточный транспорт1,2,деградация белка5и др. Существенная часть этих процессов включает в себя различные элементы клеточного цитоскелета, в том числе и микротрубочки.
Первичные клетки человека являются лучшей моделью для максимально точного воспроизведения событий, происходящих в клетках пациента. Для создания таких моделей необходимо изолировать клетки из биопсийного материала человека (например, из хирургических образцов). Полученная первичная клеточная линия подходит для изучения патогенеза с использованием различных генетических, биохимических, молекулярных и клеточных методов биологии. Также первичные клеточные культуры человека служат предшественником для создания различных трансдифференцированных и трансгенных культур6.
Однако, в отличие от увековеченных клеточных культур, существенным недостатком первичных клеток является их ограниченная проходная способность. Поэтому мы рекомендуем использовать клетки на ранней стадии прохождения (до 15). Старые культуры очень быстро вырождаются, теряя свои уникальные свойства. Таким образом, вновь полученные первичные клетки следует хранить замороженными для длительного хранения.
Первичные клеточные культуры восприимчивы к условиям культивирования. Поэтому они часто требуют уникальных подходов и оптимизации условий выращивания. В частности, первичные фибробласты кожи человека, используемые в наших экспериментах, требовательны к субстрату. Следовательно, мы использовали различные дополнительные покрытия (например, желатин или фибронектин) в зависимости от типа эксперимента.
Клеточный цитоскелет определяет форму клетки, подвижность и локомоцию. Динамика цитоскелета имеет решающее значение для многих внутриклеточных процессов как в интерфазе, так и при митозе. В частности, цитоскелеты, полимеризованные из тубулина, обладают высокодинамичными и полярными структурами, обеспечивающими моторный белково-опосредованный направленный внутриклеточный транспорт. Концы микротрубочек находятся в постоянной перестановке, фазы их сборки чередуются с фазами разборки, и такое поведение называется «динамической нестабильностью»7,8,9. Различные ассоциированные белки смещают равновесие реакции полимеризации, приводя либо к образованию полимера, либо к образованию белкового мономера. Добавление субъединиц тубулина происходит в основном на плюс-конце микротрубочек10. Семейство конечных связывающих (EB) белков состоит из трех членов: EB1, EB2 и EB3. Они служат плюс-концевыми белками (+ТИПы) и регулируют динамические свойства микротрубочек, связывая и стабилизируя их растущие плюс-концы11.
Во многих исследованиях используется микроинъекция или трансфекция флуоресцентных молекул тубулина с покадровой визуализацией и видеоанализом для визуализации микротрубочек in vitro. Эти методы могут быть инвазивными и вредными для клеток, особенно первичных клеток человека. Наиболее сложным шагом является поиск условий для трансфекции клеток. Мы попытались достичь максимально возможного уровня трансфекции, не влияя на жизнеспособность и морфологию нативных клеток. В данном исследовании применяется классический метод изучения различий в динамике микротрубочек в фибробластах кожи здоровых доноров и пациентов с болезнью Гентингтона.
Protocol
Representative Results
Discussion
Более качественные результаты анализа динамики микротрубочек могут быть получены из высококачественных микроскопических изображений. Важно соблюдать все необходимые условия для покадровой визуализации живых клеток и правильно корректировать параметры визуализации. Важно использ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Данное исследование финансировалось Министерством науки и высшего образования Российской Федерации, грант No 075-15-2019-1669 (трансфекция фибробластов), Российским научным фондом, грант No 19-15-00425 (все остальные работы по выращиванию фибробластов in vitro). Она была частично поддержана программой развития МГУ им. М.В. Ломоносова PNR5.13 (визуализация и анализ). Авторы признают поддержку Центра передового опыта «Никон» при Институте физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского. Мы хотим выразить особую благодарность Екатерине Таран за помощь в озвучивании. Авторы также благодарят Павла Беликова за помощь в монтаже видео. Рисунки в рукописи были созданы с BioRender.com.
Materials
| Instrumentation | |||
| Camera iXon DU897 EMCCD | Andor Technology | ||
| Eppendorf Centrifuge 5804 R | Eppendorf Corporate | ||
| Fluorescence filter set HYQ FITC | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| LUNA-II Automated Cell Counte | Logos Biosystems | L40002 | |
| Microscope incubator for lifetime filming | Okolab | Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS | |
| Gas controller CO2-O2-UNIT-BL | |||
| Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13) | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Software | |||
| Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c) | Open source image processing software | ||
| NIS Elements | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Additional reagents | |||
| Mineral oil (Light white oil) | MP | 151694 | |
| Cell culture dish | |||
| Cell Culture Dish | SPL Lifesciences | 20035 | |
| Confocal Dish (glass thickness 170 µm) | SPL Lifesciences | 211350 | Alternative: MatTek |
| Conical Centrifuge tube | SPL Lifesciences | 50015 | |
| Cryogenic Vials | Corning-Costar | 430659 | |
| Microcentrifuge Tube | Nest | 615001 | |
| Cultivation | |||
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Dimethyl sulfoxide | PanEko |  135 |
|
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | PanEko | C420 |
|
| DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution) | PanEko | P060 |
|
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | K053/SH30071.03 | |
| Gelatin (bovine skin) | PanEko | 070 |
|
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Opti-MEM (1x) + Glutamax | Gibco | 519850026 | |
| Penicillin-streptomycin | PanEko | A063 |
|
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| Transfection | |||
| Plasmid DNA with EB3-GFP | Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam] |
Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003 |
References
- Engelender, S., et al. Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin. Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).
- Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L. Huntingtin facilitates dynein/dynactin-mediated vesicle transport. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (24), 10045-10050 (2007).
- MacMillan, J. C., et al. Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington’s disease mutation. The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).
- Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S. Protein-protein interactions of huntingtin in the hippocampus. Molecular Biology. 51 (4), 647-653 (2017).
- Steffan, J. S., et al. The Huntington’s disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).
- Nekrasov, E. D., et al. Manifestation of Huntington’s disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
- Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).
- Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13 (1), 83-117 (1997).
- Allen, C., Borisy, G. G. Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella. Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).
- Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
- Shelden, E., Wadsworth, P. Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific. Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).
- O’Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules. Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).
- Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).
- Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates. Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).
- Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration. International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).
- van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).
- Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
- Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary. Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).
- Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy. PLoS One. 11 (7), 0158884 (2016).
- Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).
- Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media. Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).
