Prøvepreparering og relativ kvantrasjon ved bruk av reduktiv metylering av aminer for peptidomikkstudier
Summary
Denne artikkelen beskriver en prøveprepareringsmetode basert på varmeinaktivering for å bevare endogene peptider som unngår nedbrytning etter mortem, etterfulgt av relativ kvantisering ved hjelp av isotopisk merking pluss LC-MS.
Abstract
Peptidomikk kan defineres som kvalitativ og kvantitativ analyse av peptider i en biologisk prøve. Dens viktigste anvendelser inkluderer å identifisere peptidbiomarkører av sykdom eller miljøstress, identifisere nevropeptider, hormoner og bioaktive intracellulære peptider, oppdage antimikrobielle og nutraceutical peptider fra proteinhydrolysater, og kan brukes i studier for å forstå de proteolytiske prosessene. Det nylige fremskrittet innen prøvepreparering, separasjonsmetoder, massespektrometriteknikker og beregningsverktøy relatert til proteinsekvensering har bidratt til økningen av det identifiserte peptidnummeret og peptidomer karakterisert. Peptidomiske studier analyserer ofte peptider som er naturlig generert i celler. Her beskrives en prøveforberedelsesprotokoll basert på varmeinaktivering, som eliminerer proteaseaktivitet og ekstraksjon med milde forhold, så det er ingen peptidbindinger spalting. I tillegg er den relative mengden peptider ved hjelp av stabil isotopmerking ved reduktiv metylering av aminer også vist. Denne merkingsmetoden har noen fordeler ettersom reagensene er kommersielt tilgjengelige, billige sammenlignet med andre, kjemisk stabile og tillater analyse av opptil fem prøver i en enkelt LC-MS-kjøring.
Introduction
“Omics” vitenskaper er preget av den dype analysen av et molekylsett, som DNA, RNA, proteiner, peptider, metabolitter, etc. Disse genererte store datasett (genomikk, transkripsjon, proteomikk, peptidomikk, metabolomikk, etc.) har revolusjonert biologien og ført til en avansert forståelse av biologiske prosesser1. Begrepet peptidomikk begynte å bli introdusert tidlig på 1900-tallet, og noen forfattere har referert til det som en gren av proteomikk2. Peptidomi har imidlertid distinkte særegenheter, hvor hovedinteressen er å undersøke det naturlig genererte peptidinnholdet under cellulære prosesser, samt karakterisering av biologisk aktivitet av disse molekylene3,4.
I utgangspunktet var bioaktive peptidstudier begrenset til nevropeptider og hormonpeptider gjennom Edman nedbrytning og radioimmunoassay. Imidlertid tillater disse teknikkene ikke en global analyse, avhengig av isolasjon av hvert peptid i høye konsentrasjoner, tid for generering av antistoffer, i tillegg til kryssreaktivitetsmulighet5.
Peptidomikkanalyse ble først gjort mulig etter flere fremskritt innen væskekromatografi koblet massespektrometri (LC-MS) og genomprosjekter som leverte omfattende datapooler for proteomikk/peptidomikkstudier6,7. Videre måtte det etableres en spesifikk peptidekstraksjonsprotokoll for peptidomer fordi de første studiene som analyserte nevropeptider globalt i hjerneprøver, viste at deteksjon ble påvirket av massiv nedbrytning av proteiner, som hovedsakelig forekommer i dette vevet etter 1 min post-mortem. Tilstedeværelsen av disse peptidfragmentene maskerte nevropeptidsignalet og representerte ikke peptidomet in vivo. Dette problemet ble løst hovedsakelig ved bruk av rask oppvarming av proteaser ved hjelp av mikrobølgebestråling, noe som drastisk reduserte tilstedeværelsen av disse artefaktfragmentene og tillot ikke bare identifisering av nevropeptidfragmenter, men avslørte tilstedeværelsen av et sett med peptider fra cytosyosolic, mitokondrie og kjerneproteiner, forskjellig fra degradome6,8,9.
Disse metodologiske prosedyrene tillot en utvidelse av peptidomet utover de kjente nevropeptidene, hvor hundrevis av intracellulære peptider generert hovedsakelig ved virkningen av proteasomer har blitt identifisert i gjær10, sebrafisk11, gnagervev12 og menneskelige celler13. Dusinvis av disse intracellulære peptidene har vist seg å ha både biologiske og farmakologiske aktiviteter14,15. Videre kan disse peptidene brukes som sykdomsbiomarkører og muligens ha klinisk betydning, som vist i cerebrospinalvæske fra pasienter med intrakraniell saccular aneurisme16.
For tiden, i tillegg til identifisering av peptidsekvenser, er det mulig gjennom massespektrometri å skaffe data om absolutt og relativ kvantifisering. I absolutt kvantasjon sammenlignes peptidnivåene i en biologisk prøve med syntetiske standarder, mens peptidnivåene i den relative mengden sammenlignes mellom to eller flere prøver17. Relativ kvantgering kan utføres ved hjelp av følgende tilnærminger: 1) “etikettfri”18; 2) in vivo metabolsk merking eller 3) kjemisk merking. De to siste er basert på bruk av stabile isotopiske former innlemmet i peptider19,20. I etikettfri analyse estimeres peptidnivåene ved å vurdere signalstyrken (spektraltall) under LC-MS18. Imidlertid kan isotopisk merking oppnå mer nøyaktige relative nivåer av peptider.
Mange peptotomiske studier brukte trimethylammonium butyrate (TMAB) merking reagenser som kjemisk merking, og mer nylig, Reduktiv metylering av aminer (RMA) med deuterated og ikke-deutered former for formaldehyd og natrium cyanoborohydrid reagenser har blitt brukt11,21,22. TMAB-etikettene er imidlertid ikke kommersielt tilgjengelige, og synteseprosessen er veldig arbeidskrevende. På den annen side, i RMA, er reagensene kommersielt tilgjengelige, billige sammenlignet med andre etiketter, prosedyren er enkel å utføre, og de merkede peptidene er stabile23,24.
Bruken av RMA innebærer å danne en Schiff-base ved å la peptidene reagere med formaldehyd, etterfulgt av en reduksjonsreaksjon gjennom cyanoborohydridet. Denne reaksjonen forårsaker dimetylering av frie aminogrupper på N-terminaler og lysin sidekjeder og monometylater N-terminal prolines. Hvordan prolinrester ofte er sjeldne på N-terminalen, er praktisk talt alle peptider med frie aminer på N-terminus merket med to metylgrupper23,24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
I de fleste peptidomikkstudier er et av de kritiske trinnene uten tvil prøvepreparatet som bør utføres nøye for å unngå tilstedeværelse av peptidfragmenter generert av proteaser etter noen minutter etter mortem. De første studiene på hjerneekstrakter utarbeidet fra ikke-mikrobølgede prøver viste et stort antall proteinfragmenter som skulle være til stede i mikrofiltreringene på 10 kDa. Ulike tilnærminger har blitt beskrevet for å unngå peptidspektra fra proteinforringelse: fokusert mikrobølgebestråling …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Utviklingen og bruken av teknikkene beskrevet her ble støttet av Det brasilianske nasjonale forskningsrådets tilskudd 420811/2018-4 (LMC); Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) tilskudd 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) og 21/01286-1 (MEME). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om publisering eller utarbeidelse av artikkelen.
Materials
| 10 kDa cut-off filters | Merck Millipore | UFC801024 | Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrane, 10 kDa |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 11213 | |
| analytical column (EASY-Column) | EASY-Column | (SC200) | 10 cm, ID75 µm, 3 µm, C18-A2 |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | MS-222 |
| Fluorescamine | Sigma-Aldrich | F9015 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde-13C, d2, solution | Sigma-Aldrich | 596388 | |
| Formaldehyde-d2 solution | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 33015 | |
| Fume hood | Quimis | Q216 | |
| Hydrochloric acid – HCl | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| LoBind-Protein retention tubes | Eppendorf | EP0030108116-100EA | |
| LTQ-Orbitrap Velos | Thermo Fisher Scientific | LTQ Velos | |
| Microwave oven | Panasonic | NN-ST67HSRU | |
| n Easy-nLC II nanoHPLC | Thermo Fisher Scientific | LC140 | |
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions Inc. | VERSION 8.5 | |
| Phosphate-buffered saline | Invitrogen | 3002 | tablets |
| precolumn (EASY-Column) | Thermo Fisher Scientific | (SC001) | 2 cm, ID100 µm, 5 µm, C18-A1 |
| Refrigerated centrifuge | Hermle | Z326K | for conical tubes |
| Refrigerated centrifuge | Vision | VS15000CFNII | for microtubes |
| Reversed-phase cleanup columns (Oasis HLB 1 cc Cartridge) | Waters | 186000383 | Oasis HLB 1 cc Cartridge |
| Sodium cyanoborodeuteride – NaBD3CN | Sigma-Aldrich | 190020 | |
| Sodium cyanoborohydride – NaBH3CN | Sigma-Aldrich | 156159 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | NOTE: 0.2 M PB= 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (26.85 mL of Na2HPO3 1M) plus 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (23.15 mL of NaH2PO3 1M) to 250 ml of water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| Sonicator | Qsonica | Q55-110 | |
| Standard peptide | Proteimax | amino acid sequence: LTLRTKL | |
| Triethylammonium buffer – TEAB 1 M | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid – TFA | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultra purified water | Milli-Q | Direct-Q 3UV | |
| Vacuum centrifuge | GeneVac | MiVac DNA concentrator | |
| Water bath | Cientec | 266 | |
| Xcalibur Software | ThermoFisher Scientific | OPTON-30965 |
References
- Kandpal, R., Saviola, B., Felton, J. The era of ‘omics unlimited. Biotechniques. 46 (5), 354-355 (2009).
- Farrokhi, N., Whitelegge, J. P., Brusslan, J. A. Plant peptides and peptidomics. Plant Biotechnology Journal. 6 (2), 105-134 (2008).
- Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Zucht, H. D. The peptidomics concept. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 8 (8), 697-704 (2005).
- Dallas, D. C., et al. Current peptidomics: applications, purification, identification, quantification, and functional analysis. Proteomics. 15 (5-6), 1026-1038 (2015).
- Chard, T. An introduction to radioimmunoassay and related techniques (3rd Ed). FEBS Letters. 238 (1), 223 (1988).
- Svensson, M., Sköld, K., Svenningsson, P., Andren, P. E. Peptidomics-based discovery of novel neuropeptides. Journal of Proteome Research. 2 (2), 213-219 (2003).
- Baggerman, G., et al. Peptidomics. Journal of Chromatography B. 803, 3-16 (2004).
- Theodorsson, E., Stenfors, C., Mathe, A. A. Microwave irradiation increases recovery of neuropeptides from brain tissues. Peptides. 11, 1191-1197 (1990).
- Che, F. Y., Lim, J., Pan, H., Biswas, R., Fricker, L. D. Quantitative neuropeptidomics of microwave-irradiated mouse brain and pituitary. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 1391-1405 (2005).
- Dasgupta, S., et al. Analysis of the yeast peptidome and comparison with the human peptidome. PLoS One. 11 (9), 0163312 (2016).
- Teixeira, C. M. M., Correa, C. N., Iwai, L. K., Ferro, E. S., Castro, L. M. Characterization of Intracellular Peptides from Zebrafish (Danio rerio) Brain. Zebrafish. 16 (3), 240-251 (2019).
- Fricker, L. D. Analysis of mouse brain peptides using mass spectrometry-based peptidomics: implications for novel functions ranging from non-classical neuropeptides to microproteins. Molecular BioSystems. 6 (8), 1355-1365 (2010).
- Gelman, J. S., Sironi, J., Castro, L. M., Ferro, E. S., Fricker, L. D. Peptidomic analysis of human cell lines. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1583-1592 (2011).
- De Araujo, C. B., et al. Intracellular peptides in cell biology and pharmacology. Biomolecules. 9, 150 (2019).
- Gewehr, M. C. F., Silverio, R., Rosa-Neto, J. C., Lira, F. S., Reckziegel, P., Ferro, E. S. Peptides from natural or rationally designed sources can be used in overweight, obesity, and type 2 diabetes therapies. Molecules. 25 (5), 1093 (2020).
- Sakaya, G. R., et al. Peptidomic profiling of cerebrospinal fluid from patients with intracranial saccular aneurysms. Journal of Proteomics. 240 (3), 104188 (2021).
- Fricker, L. Quantitative peptidomics: General considerations. Methods in Molecular Biology. 1719, 121-140 (2018).
- Southey, B. R., et al. Comparing label-free quantitative peptidomics approaches to characterize diurnal variation of peptides in the rat suprachiasmatic nucleus. Analytical Chemistry. 86 (1), 443-452 (2014).
- Chen, X., Wei, S., Ji, Y., Guo, X., Yang, F. Quantitative proteomics using SILAC: Principles, applications, and developments. Proteomics. 15 (18), 3175-3192 (2015).
- Boonen, K., et al. Quantitative peptidomics with isotopic and isobaric tags. Methods in Molecular Biology. 1719, 141-159 (2018).
- Gewehr, M. C. F., et al. The relevance of thimet oligopeptidase in the regulation of energy metabolism and diet-induced obesity. Biomolecules. 10 (2), 321 (2020).
- Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model. Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
- Dasgupta, S., Castro, L. M., Tashima, A. K., Fricker, L. Quantitative peptidomics using reductive methylation of amines. Methods in Molecular Biology. 1719, 161-174 (2018).
- Tashima, A. K., Fricker, L. D. Quantitative peptidomics with five-plex reductive methylation labels. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 866-878 (2018).
- Che, F. Y., et al. Optimization of neuropeptide extraction from the mouse hypothalamus. Journal of Proteome Research. 6 (12), 4667-4676 (2007).
- Lyons, P. J., Fricker, L. D. Peptidomic approaches to study proteolytic activity. Current Protocols in Protein Science. , 13 (2011).
- Udenfriend, S., et al. Fluorescamine: a reagent for assay of amino acids, peptides, proteins, and primary amines in the picomole range. Science. 178 (4063), 871-872 (1972).
- Ma, B., et al. PEAKS: powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (20), 2337-2342 (2003).
- Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (4), 1-8 (2012).
- Sturm, R. M., Dowell, J. A., Li, L. Rat brain neuropeptidomics: tissue collection, protease inhibition, neuropeptide extraction, and mass spectrometric analysis. Methods in Molecular Biology. 615, 217-226 (2010).
- Fricker, L. D. Limitations of mass spectrometry-based peptidomic approaches. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (12), 1981-1991 (2015).
- Ross, , et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & Cellular Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).
