Peptidomik Çalışmalar için Aminlerin Indirgeyici Metilasyonunu Kullanarak Numune Hazırlama ve Göreli Nicellik
Summary
Bu makalede, ölüm sonrası bozulmayı önleyen endojen peptitleri korumak için ısı inaktivasyonuna dayanan bir örnek hazırlama yöntemi ve ardından izotopik etiketleme artı LC-MS kullanarak göreli nicelik açıklanmaktadır.
Abstract
Peptidomik, biyolojik bir örnekteki peptitlerin nitel ve nicel analizi olarak tanımlanabilir. Başlıca uygulamaları arasında hastalık veya çevresel stresin peptit biyobelirteçlerinin tanımlanması, nöropeptidlerin, hormonların ve biyoaktif hücre içi peptitlerin tanımlanması, protein hidrolisatlarından antimikrobiyal ve nutraceutical peptitlerin keşfedilmesi ve proteolitik süreçlerin anlaşılması için yapılan çalışmalarda kullanılabilecektir. Numune hazırlama, ayırma yöntemleri, kütle spektrometresi teknikleri ve protein dizilimi ile ilgili hesaplamalı araçlardaki son gelişmeler, tanımlanan peptit sayısının ve karakterize peptidomların artmasına katkıda bulunmuştur. Peptidomik çalışmalar sıklıkla hücrelerde doğal olarak üretilen peptitleri analiz eder. Burada, ısı inaktivasyonuna dayanan, proteaz aktivitesini ortadan kaldıran ve hafif koşullarla ekstraksiyon yapan bir örnek hazırlama protokolü tanımlanmıştır, bu nedenle peptit bağları bölünmesi yoktur. Ek olarak, aminlerin indirgeyici metilasyonu ile kararlı izotop etiketlemesi kullanılarak peptitlerin bağıl niceliği de gösterilmiştir. Reaktifler ticari olarak mevcut, diğerlerine göre ucuz, kimyasal olarak kararlı ve tek bir LC-MS çalışmasında beş numunenin analizine izin verdiğinden, bu etiketleme yönteminin bazı avantajları vardır.
Introduction
“Omics” bilimleri, DNA, RNA, proteinler, peptitler, metabolitler vb. Bu büyük ölçekli veri kümeleri (genomik, transkriptomik, proteomik, peptidomik, metabolomik vb.) biyolojide devrim yaratmış ve biyolojik süreçlerin ileri düzeyde anlaşılmasına yol açmıştır1. Peptidomik terimi 20. Bununla birlikte, peptidomiklerin belirgin özellikleri vardır, burada ana ilgi hücresel süreçler sırasında doğal olarak üretilen peptit içeriğini ve bu moleküllerin biyolojik aktivitesinin karakterizasyonunu araştırmaktır3,4.
Başlangıçta, biyoaktif peptit çalışmaları Edman bozulması ve radyoimmünoassay yoluyla nöropeptitler ve hormon peptitleri ile sınırlandırıldı. Bununla birlikte, bu teknikler, her peptitin yüksek konsantrasyonlarda izolasyonuna, antikorların üretilmesi için zamana bağlı olarak, çapraz reaktivite olasılığının yanı sıra küresel bir analize izin vermez5.
Peptidomik analizi ancak Sıvı kromatografisi kütle spektrometresi (LC-MS) ve proteomik/peptidomik çalışmaları için kapsamlı veri havuzları sağlayan genom projelerinde birkaç ilerlemeden sonra mümkün oldu6,7. Ayrıca, peptidomlar için belirli bir peptit ekstraksiyon protokolünün oluşturulması gerekiyordu, çünkü beyin örneklerinde nöropeptidleri küresel olarak analiz eden ilk çalışmalar, tespitin proteinlerin büyük ölçüde bozulmasından etkilendiğini gösterdi, bu da esas olarak bu dokuda 1 dakika sonra meydana geldi. Bu peptit parçalarının varlığı nöropeptid sinyalini maskeledi ve peptidom in vivo’yu temsil etmedi. Bu sorun esas olarak mikrodalga ışınlama kullanılarak proteazların hızlı ısınma inaktivasyonu uygulaması ile çözüldü, bu da bu eser parçalarının varlığını büyük ölçüde azalttı ve sadece nöropeptid parçalarının tanımlanmasına izin vermedi, aynı zamanda sitosolik, mitokondriyal ve nükleer proteinlerden bir dizi peptidin varlığını ortaya çıkardı, bozulmadan farklı6,8,9.
Bu metodolojik prosedürler, peptidomun, esas olarak proteazomların etkisiyle üretilen yüzlerce hücre içi peptitin maya10, zebra balığı11, kemirgen dokuları12 ve insan hücrelerinde tanımlandığı tanınmış nöropeptitlerin ötesine genişlemesine izin verdi13. Bu hücre içi peptitlerin düzinelercesinin hem biyolojik hem de farmakolojik aktiviteleri olduğu yaygın olarak gösterilmiştir14,15. Ayrıca, bu peptitler intrakraniyal sakküler anevrizması olan hastalardan beyin omurilik sıvısında gösterildiği gibi hastalık biyobelirteçleri olarak kullanılabilir ve muhtemelen klinik öneme sahiptir16.
Şu anda, peptit dizilerinin tanımlanmasına ek olarak, mutlak ve göreceli nicelik verilerini elde etmek için kütle spektrometresi ile mümkündür. Mutlak nicellikte, biyolojik bir numunedeki peptit seviyeleri sentetik standartlarla karşılaştırılırken, göreceli nicelikte peptit seviyeleri iki veya daha fazla örnek arasında karşılaştırılır17. Göreli nicelik aşağıdaki yaklaşımlar kullanılarak gerçekleştirilebilir: 1) “etiketsiz”18; 2) in vivo metabolik etiketleme veya 3) kimyasal etiketleme. Son ikisi peptitlere dahil edilmiş kararlı izotopik formların kullanımına dayanmaktadır19,20. Etiketsiz analizde, peptit seviyeleri LC-MS18 sırasında sinyal gücü (spektral sayımlar) dikkate alınarak tahmin edilir. Bununla birlikte, izotopik etiketleme daha doğru bağıl peptit seviyeleri elde edebilir.
Birçok peptidomik çalışmada trimetilamimonyum bütirat (TMAB) reaktifleri kimyasal etiketleme olarak etiketlenerek ve daha yakın zamanda, Aminlerin (RMA) döterlenmiş ve döterlenmemiş formaldehit ve sodyum siyanoborohidrit reaktif formları ile indirgeyici Metilasyonu kullanılmıştır11,21,22. Bununla birlikte, TMAB etiketleri ticari olarak mevcut değildir ve sentez süreci çok zahmetlidir. Öte yandan, RMA’da, reaktifler ticari olarak mevcuttur, diğer etiketlere kıyasla ucuzdur, prosedürün gerçekleştirilmesi kolaydır ve etiketli peptitler kararlıdır23,24.
RMA kullanımı, peptitlerin formaldehit ile reaksiyona girmesine izin vererek bir Schiff tabanı oluşturmayı ve ardından siyanoborohidrit yoluyla bir azaltma reaksiyonunun oluşturulmasını içerir. Bu reaksiyon, N-terminallerinde ve lizin yan zincirlerinde ve monometrilatlar N-terminal prolines’larında serbest amino grupların dimetilasyonuna neden olur. Prolin kalıntılarının N-terminalinde genellikle nasıl nadir olduğu, pratik olarak N-terminusta serbest aminlere sahip tüm peptitler iki metil grubu ile etiketlenmiştir23,24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çoğu peptidomik çalışmada, kritik adımlardan biri, şüphesiz, proteazlar tarafından üretilen peptit parçalarının ölümünden birkaç dakika sonra varlığını önlemek için dikkatlice yapılması gereken örnek preparattır. Mikrodalga olmayan örneklerden hazırlanan beyin özleri üzerinde yapılan ilk çalışmalarda, 10 kDa mikrofiltratlarda çok sayıda protein parçasının bulunduğu görüldü. Protein bozulmasından peptit spektrumunu önlemek için farklı yaklaşımlar tanımlanmıştır: odakla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Burada açıklanan tekniklerin geliştirilmesi ve kullanımı Brezilya Ulusal Araştırma Konseyi hibe 420811/2018-4 (LMC) tarafından desteklendi; Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) ve 21/01286-1 (MEME) hibeleri verir. Fon sağlayıcılar çalışma tasarımında, veri toplama ve analizinde, yayınlanma kararında veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rol oynamamışlardır.
Materials
| 10 kDa cut-off filters | Merck Millipore | UFC801024 | Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrane, 10 kDa |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 11213 | |
| analytical column (EASY-Column) | EASY-Column | (SC200) | 10 cm, ID75 µm, 3 µm, C18-A2 |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | MS-222 |
| Fluorescamine | Sigma-Aldrich | F9015 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde-13C, d2, solution | Sigma-Aldrich | 596388 | |
| Formaldehyde-d2 solution | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 33015 | |
| Fume hood | Quimis | Q216 | |
| Hydrochloric acid – HCl | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| LoBind-Protein retention tubes | Eppendorf | EP0030108116-100EA | |
| LTQ-Orbitrap Velos | Thermo Fisher Scientific | LTQ Velos | |
| Microwave oven | Panasonic | NN-ST67HSRU | |
| n Easy-nLC II nanoHPLC | Thermo Fisher Scientific | LC140 | |
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions Inc. | VERSION 8.5 | |
| Phosphate-buffered saline | Invitrogen | 3002 | tablets |
| precolumn (EASY-Column) | Thermo Fisher Scientific | (SC001) | 2 cm, ID100 µm, 5 µm, C18-A1 |
| Refrigerated centrifuge | Hermle | Z326K | for conical tubes |
| Refrigerated centrifuge | Vision | VS15000CFNII | for microtubes |
| Reversed-phase cleanup columns (Oasis HLB 1 cc Cartridge) | Waters | 186000383 | Oasis HLB 1 cc Cartridge |
| Sodium cyanoborodeuteride – NaBD3CN | Sigma-Aldrich | 190020 | |
| Sodium cyanoborohydride – NaBH3CN | Sigma-Aldrich | 156159 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | NOTE: 0.2 M PB= 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (26.85 mL of Na2HPO3 1M) plus 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (23.15 mL of NaH2PO3 1M) to 250 ml of water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| Sonicator | Qsonica | Q55-110 | |
| Standard peptide | Proteimax | amino acid sequence: LTLRTKL | |
| Triethylammonium buffer – TEAB 1 M | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid – TFA | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultra purified water | Milli-Q | Direct-Q 3UV | |
| Vacuum centrifuge | GeneVac | MiVac DNA concentrator | |
| Water bath | Cientec | 266 | |
| Xcalibur Software | ThermoFisher Scientific | OPTON-30965 |
References
- Kandpal, R., Saviola, B., Felton, J. The era of ‘omics unlimited. Biotechniques. 46 (5), 354-355 (2009).
- Farrokhi, N., Whitelegge, J. P., Brusslan, J. A. Plant peptides and peptidomics. Plant Biotechnology Journal. 6 (2), 105-134 (2008).
- Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Zucht, H. D. The peptidomics concept. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 8 (8), 697-704 (2005).
- Dallas, D. C., et al. Current peptidomics: applications, purification, identification, quantification, and functional analysis. Proteomics. 15 (5-6), 1026-1038 (2015).
- Chard, T. An introduction to radioimmunoassay and related techniques (3rd Ed). FEBS Letters. 238 (1), 223 (1988).
- Svensson, M., Sköld, K., Svenningsson, P., Andren, P. E. Peptidomics-based discovery of novel neuropeptides. Journal of Proteome Research. 2 (2), 213-219 (2003).
- Baggerman, G., et al. Peptidomics. Journal of Chromatography B. 803, 3-16 (2004).
- Theodorsson, E., Stenfors, C., Mathe, A. A. Microwave irradiation increases recovery of neuropeptides from brain tissues. Peptides. 11, 1191-1197 (1990).
- Che, F. Y., Lim, J., Pan, H., Biswas, R., Fricker, L. D. Quantitative neuropeptidomics of microwave-irradiated mouse brain and pituitary. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 1391-1405 (2005).
- Dasgupta, S., et al. Analysis of the yeast peptidome and comparison with the human peptidome. PLoS One. 11 (9), 0163312 (2016).
- Teixeira, C. M. M., Correa, C. N., Iwai, L. K., Ferro, E. S., Castro, L. M. Characterization of Intracellular Peptides from Zebrafish (Danio rerio) Brain. Zebrafish. 16 (3), 240-251 (2019).
- Fricker, L. D. Analysis of mouse brain peptides using mass spectrometry-based peptidomics: implications for novel functions ranging from non-classical neuropeptides to microproteins. Molecular BioSystems. 6 (8), 1355-1365 (2010).
- Gelman, J. S., Sironi, J., Castro, L. M., Ferro, E. S., Fricker, L. D. Peptidomic analysis of human cell lines. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1583-1592 (2011).
- De Araujo, C. B., et al. Intracellular peptides in cell biology and pharmacology. Biomolecules. 9, 150 (2019).
- Gewehr, M. C. F., Silverio, R., Rosa-Neto, J. C., Lira, F. S., Reckziegel, P., Ferro, E. S. Peptides from natural or rationally designed sources can be used in overweight, obesity, and type 2 diabetes therapies. Molecules. 25 (5), 1093 (2020).
- Sakaya, G. R., et al. Peptidomic profiling of cerebrospinal fluid from patients with intracranial saccular aneurysms. Journal of Proteomics. 240 (3), 104188 (2021).
- Fricker, L. Quantitative peptidomics: General considerations. Methods in Molecular Biology. 1719, 121-140 (2018).
- Southey, B. R., et al. Comparing label-free quantitative peptidomics approaches to characterize diurnal variation of peptides in the rat suprachiasmatic nucleus. Analytical Chemistry. 86 (1), 443-452 (2014).
- Chen, X., Wei, S., Ji, Y., Guo, X., Yang, F. Quantitative proteomics using SILAC: Principles, applications, and developments. Proteomics. 15 (18), 3175-3192 (2015).
- Boonen, K., et al. Quantitative peptidomics with isotopic and isobaric tags. Methods in Molecular Biology. 1719, 141-159 (2018).
- Gewehr, M. C. F., et al. The relevance of thimet oligopeptidase in the regulation of energy metabolism and diet-induced obesity. Biomolecules. 10 (2), 321 (2020).
- Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model. Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
- Dasgupta, S., Castro, L. M., Tashima, A. K., Fricker, L. Quantitative peptidomics using reductive methylation of amines. Methods in Molecular Biology. 1719, 161-174 (2018).
- Tashima, A. K., Fricker, L. D. Quantitative peptidomics with five-plex reductive methylation labels. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 866-878 (2018).
- Che, F. Y., et al. Optimization of neuropeptide extraction from the mouse hypothalamus. Journal of Proteome Research. 6 (12), 4667-4676 (2007).
- Lyons, P. J., Fricker, L. D. Peptidomic approaches to study proteolytic activity. Current Protocols in Protein Science. , 13 (2011).
- Udenfriend, S., et al. Fluorescamine: a reagent for assay of amino acids, peptides, proteins, and primary amines in the picomole range. Science. 178 (4063), 871-872 (1972).
- Ma, B., et al. PEAKS: powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (20), 2337-2342 (2003).
- Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (4), 1-8 (2012).
- Sturm, R. M., Dowell, J. A., Li, L. Rat brain neuropeptidomics: tissue collection, protease inhibition, neuropeptide extraction, and mass spectrometric analysis. Methods in Molecular Biology. 615, 217-226 (2010).
- Fricker, L. D. Limitations of mass spectrometry-based peptidomic approaches. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (12), 1981-1991 (2015).
- Ross, , et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & Cellular Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).
