Пробоподготовка и относительное количественное определение с использованием восстановительного метилирования аминов для исследований пептидомики
Summary
В этой статье описывается метод пробоподготовки, основанный на тепловой инактивации для сохранения эндогенных пептидов, избегающих деградации посмертно, с последующим относительным количественным определением с использованием изотопной маркировки плюс LC-MS.
Abstract
Пептидомику можно определить как качественный и количественный анализ пептидов в биологическом образце. Его основные применения включают идентификацию пептидных биомаркеров заболевания или экологического стресса, идентификацию нейропептидов, гормонов и биологически активных внутриклеточных пептидов, обнаружение антимикробных и нутрицевтических пептидов из гидролизатов белка и могут быть использованы в исследованиях для понимания протеолитических процессов. Недавний прогресс в подготовке образцов, методах разделения, методах масс-спектрометрии и вычислительных инструментах, связанных с секвенированием белка, способствовал увеличению числа идентифицированных пептидов и характеризуемых пептидов. Пептидомические исследования часто анализируют пептиды, которые естественным образом генерируются в клетках. Здесь описан протокол пробоподготовки, основанный на термоинактивации, который исключает активность протеазы и экстракцию в мягких условиях, поэтому нет расщепления пептидных связей. Кроме того, показано относительное количественное определение пептидов с использованием метки стабильных изотопов путем восстановительного метилирования аминов. Этот метод маркировки имеет некоторые преимущества, поскольку реагенты коммерчески доступны, недороги по сравнению с другими, химически стабильны и позволяют анализировать до пяти образцов за один прогон LC-MS.
Introduction
«Омические» науки характеризуются глубоким анализом набора молекул, таких как ДНК, РНК, белки, пептиды, метаболиты и т.д. Эти крупномасштабные наборы данных (геномика, транскриптомика, протеомика, пептидомика, метаболомика и т. д.) произвели революцию в биологии и привели к продвинутому пониманию биологических процессов1. Термин пептидомика начал вводиться в начале 20 века, и некоторые авторы называли его ветвью протеомики2. Однако пептидомика имеет отличительные особенности, где основной интерес заключается в исследовании содержания естественно генерируемых пептидов в ходе клеточных процессов, а также характеристике биологической активности этих молекул3,4.
Первоначально исследования биологически активных пептидов были ограничены нейропептидами и гормональными пептидами через деградацию Эдмана и радиоиммуноанализ. Однако эти методики не позволяют провести глобальный анализ, в зависимости от выделения каждого пептида в высоких концентрациях, времени генерации антител, кроме возможности перекрестной реактивности5.
Анализ пептидомики стал возможен только после нескольких достижений в области жидкостной хроматографии, связанной с масс-спектрометрией (LC-MS) и проектами генома, которые предоставили комплексные пулы данных для исследований протеомики / пептидомики6,7. Кроме того, необходимо было установить специфический протокол экстракции пептидов для пептидов, потому что первые исследования, которые анализировали нейропептиды в глобальном масштабе в образцах мозга, показали, что на обнаружение влияет массивная деградация белков, которая происходит в основном в этой ткани через 1 мин после вскрытия. Присутствие этих пептидных фрагментов маскировало сигнал нейропептида и не представляло собой пептидом in vivo. Эта проблема решалась в основном применением быстрой нагревательной инактивации протеаз с помощью микроволнового облучения, что резко уменьшило присутствие этих фрагментов артефактов и позволило не только идентифицировать фрагменты нейропептидов, но и выявило наличие набора пептидов из цитозольных, митохондриальных и ядерных белков, отличающихся от деградома6,8,9.
Эти методологические процедуры позволили расширить пептидом за пределы известных нейропептидов, где сотни внутриклеточных пептидов, генерируемых главным образом действием протеасом, были идентифицированы в дрожжах10, рыбках данио11, тканях грызунов12 и клетках человека13. Было широко показано, что десятки этих внутриклеточных пептидов обладают как биологической, так и фармакологической активностью14,15. Кроме того, эти пептиды могут быть использованы в качестве биомаркеров заболевания и, возможно, имеют клиническое значение, как показано в спинномозговой жидкости у пациентов с внутричерепными мешковидными аневризмами16.
В настоящее время, помимо идентификации пептидных последовательностей, можно с помощью масс-спектрометрии получить данные абсолютного и относительного количественного определения. В абсолютном количественном определении уровни пептидов в биологическом образце сравниваются с синтетическими стандартами, в то время как в относительном количественном определении уровни пептидов сравниваются между двумя или более образцами17. Относительное количественное определение может быть выполнено с использованием следующих подходов: 1) «без меток»18; 2) метаболическая маркировка in vivo или 3) химическая маркировка. Последние два основаны на использовании стабильных изотопных форм, включенных в пептиды19,20. В анализе без меток уровни пептидов оцениваются с учетом силы сигнала (спектральных показателей) во время LC-MS18. Однако изотопная маркировка может получить более точные относительные уровни пептидов.
Во многих пептидомических исследованиях в качестве химической маркировки использовался триметиламмоний бутират (TMAB), а в последнее время было использовано восстановительное метилирование аминов (RMA) с дейтерированными и невейтерированными формами формальдегида и реагентов цианоборогидрида натрия11,21,22. Однако этикетки TMAB коммерчески недоступны, а процесс синтеза очень трудоемкий. С другой стороны, в RMA реагенты коммерчески доступны, недороги по сравнению с другими этикетками, процедура проста в выполнении, а меченые пептиды стабильны23,24.
Использование RMA включает в себя формирование основания Шиффа, позволяя пептидам реагировать с формальдегидом с последующей реакцией восстановления через цианоборогидрид. Эта реакция вызывает диметилирование свободных аминогрупп на N-концевых и лизиновых боковых цепях и монометилатах N-концевых пролинов. Поскольку остатки пролина часто редки на N-конце, практически все пептиды со свободными аминами на N-конце помечены двумя метильными группами23,24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
В большинстве исследований пептидомики одним из критических этапов, без сомнения, является пробоподготовка, которую следует тщательно выполнять, чтобы избежать присутствия пептидных фрагментов, генерируемых протеазами через несколько минут после вскрытия. Первоначальные исследова?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Разработка и использование методов, описанных здесь, были поддержаны грантом Бразильского национального исследовательского совета 420811/2018-4 (LMC); Гранты Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) и 21/01286-1 (MEME). Спонсоры не играли никакой роли в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке статьи.
Materials
| 10 kDa cut-off filters | Merck Millipore | UFC801024 | Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrane, 10 kDa |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 11213 | |
| analytical column (EASY-Column) | EASY-Column | (SC200) | 10 cm, ID75 µm, 3 µm, C18-A2 |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | MS-222 |
| Fluorescamine | Sigma-Aldrich | F9015 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde-13C, d2, solution | Sigma-Aldrich | 596388 | |
| Formaldehyde-d2 solution | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 33015 | |
| Fume hood | Quimis | Q216 | |
| Hydrochloric acid – HCl | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| LoBind-Protein retention tubes | Eppendorf | EP0030108116-100EA | |
| LTQ-Orbitrap Velos | Thermo Fisher Scientific | LTQ Velos | |
| Microwave oven | Panasonic | NN-ST67HSRU | |
| n Easy-nLC II nanoHPLC | Thermo Fisher Scientific | LC140 | |
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions Inc. | VERSION 8.5 | |
| Phosphate-buffered saline | Invitrogen | 3002 | tablets |
| precolumn (EASY-Column) | Thermo Fisher Scientific | (SC001) | 2 cm, ID100 µm, 5 µm, C18-A1 |
| Refrigerated centrifuge | Hermle | Z326K | for conical tubes |
| Refrigerated centrifuge | Vision | VS15000CFNII | for microtubes |
| Reversed-phase cleanup columns (Oasis HLB 1 cc Cartridge) | Waters | 186000383 | Oasis HLB 1 cc Cartridge |
| Sodium cyanoborodeuteride – NaBD3CN | Sigma-Aldrich | 190020 | |
| Sodium cyanoborohydride – NaBH3CN | Sigma-Aldrich | 156159 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | NOTE: 0.2 M PB= 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (26.85 mL of Na2HPO3 1M) plus 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (23.15 mL of NaH2PO3 1M) to 250 ml of water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| Sonicator | Qsonica | Q55-110 | |
| Standard peptide | Proteimax | amino acid sequence: LTLRTKL | |
| Triethylammonium buffer – TEAB 1 M | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid – TFA | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultra purified water | Milli-Q | Direct-Q 3UV | |
| Vacuum centrifuge | GeneVac | MiVac DNA concentrator | |
| Water bath | Cientec | 266 | |
| Xcalibur Software | ThermoFisher Scientific | OPTON-30965 |
References
- Kandpal, R., Saviola, B., Felton, J. The era of ‘omics unlimited. Biotechniques. 46 (5), 354-355 (2009).
- Farrokhi, N., Whitelegge, J. P., Brusslan, J. A. Plant peptides and peptidomics. Plant Biotechnology Journal. 6 (2), 105-134 (2008).
- Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Zucht, H. D. The peptidomics concept. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 8 (8), 697-704 (2005).
- Dallas, D. C., et al. Current peptidomics: applications, purification, identification, quantification, and functional analysis. Proteomics. 15 (5-6), 1026-1038 (2015).
- Chard, T. An introduction to radioimmunoassay and related techniques (3rd Ed). FEBS Letters. 238 (1), 223 (1988).
- Svensson, M., Sköld, K., Svenningsson, P., Andren, P. E. Peptidomics-based discovery of novel neuropeptides. Journal of Proteome Research. 2 (2), 213-219 (2003).
- Baggerman, G., et al. Peptidomics. Journal of Chromatography B. 803, 3-16 (2004).
- Theodorsson, E., Stenfors, C., Mathe, A. A. Microwave irradiation increases recovery of neuropeptides from brain tissues. Peptides. 11, 1191-1197 (1990).
- Che, F. Y., Lim, J., Pan, H., Biswas, R., Fricker, L. D. Quantitative neuropeptidomics of microwave-irradiated mouse brain and pituitary. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 1391-1405 (2005).
- Dasgupta, S., et al. Analysis of the yeast peptidome and comparison with the human peptidome. PLoS One. 11 (9), 0163312 (2016).
- Teixeira, C. M. M., Correa, C. N., Iwai, L. K., Ferro, E. S., Castro, L. M. Characterization of Intracellular Peptides from Zebrafish (Danio rerio) Brain. Zebrafish. 16 (3), 240-251 (2019).
- Fricker, L. D. Analysis of mouse brain peptides using mass spectrometry-based peptidomics: implications for novel functions ranging from non-classical neuropeptides to microproteins. Molecular BioSystems. 6 (8), 1355-1365 (2010).
- Gelman, J. S., Sironi, J., Castro, L. M., Ferro, E. S., Fricker, L. D. Peptidomic analysis of human cell lines. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1583-1592 (2011).
- De Araujo, C. B., et al. Intracellular peptides in cell biology and pharmacology. Biomolecules. 9, 150 (2019).
- Gewehr, M. C. F., Silverio, R., Rosa-Neto, J. C., Lira, F. S., Reckziegel, P., Ferro, E. S. Peptides from natural or rationally designed sources can be used in overweight, obesity, and type 2 diabetes therapies. Molecules. 25 (5), 1093 (2020).
- Sakaya, G. R., et al. Peptidomic profiling of cerebrospinal fluid from patients with intracranial saccular aneurysms. Journal of Proteomics. 240 (3), 104188 (2021).
- Fricker, L. Quantitative peptidomics: General considerations. Methods in Molecular Biology. 1719, 121-140 (2018).
- Southey, B. R., et al. Comparing label-free quantitative peptidomics approaches to characterize diurnal variation of peptides in the rat suprachiasmatic nucleus. Analytical Chemistry. 86 (1), 443-452 (2014).
- Chen, X., Wei, S., Ji, Y., Guo, X., Yang, F. Quantitative proteomics using SILAC: Principles, applications, and developments. Proteomics. 15 (18), 3175-3192 (2015).
- Boonen, K., et al. Quantitative peptidomics with isotopic and isobaric tags. Methods in Molecular Biology. 1719, 141-159 (2018).
- Gewehr, M. C. F., et al. The relevance of thimet oligopeptidase in the regulation of energy metabolism and diet-induced obesity. Biomolecules. 10 (2), 321 (2020).
- Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model. Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
- Dasgupta, S., Castro, L. M., Tashima, A. K., Fricker, L. Quantitative peptidomics using reductive methylation of amines. Methods in Molecular Biology. 1719, 161-174 (2018).
- Tashima, A. K., Fricker, L. D. Quantitative peptidomics with five-plex reductive methylation labels. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 866-878 (2018).
- Che, F. Y., et al. Optimization of neuropeptide extraction from the mouse hypothalamus. Journal of Proteome Research. 6 (12), 4667-4676 (2007).
- Lyons, P. J., Fricker, L. D. Peptidomic approaches to study proteolytic activity. Current Protocols in Protein Science. , 13 (2011).
- Udenfriend, S., et al. Fluorescamine: a reagent for assay of amino acids, peptides, proteins, and primary amines in the picomole range. Science. 178 (4063), 871-872 (1972).
- Ma, B., et al. PEAKS: powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (20), 2337-2342 (2003).
- Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (4), 1-8 (2012).
- Sturm, R. M., Dowell, J. A., Li, L. Rat brain neuropeptidomics: tissue collection, protease inhibition, neuropeptide extraction, and mass spectrometric analysis. Methods in Molecular Biology. 615, 217-226 (2010).
- Fricker, L. D. Limitations of mass spectrometry-based peptidomic approaches. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (12), 1981-1991 (2015).
- Ross, , et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & Cellular Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).
