Denna artikel beskriver en provberedningsmetod baserad på värme-inaktivering för att bevara endogena peptider undvika nedbrytning post-mortem, följt av relativ mängd med isotopisk märkning plus LC-MS.
Peptidomik kan definieras som kvalitativ och kvantitativ analys av peptider i ett biologiskt prov. Dess huvudsakliga tillämpningar inkluderar identifiering av peptid biomarkörer för sjukdom eller miljöbelastning, identifiera neuropeptider, hormoner, och bioaktiva intracellulära peptider, upptäcka antimikrobiella och nutraceutical peptider från protein hydrolysat, och kan användas i studier för att förstå de proteolytiska processerna. Den senaste tidens framsteg inom provberedning, separationsmetoder, masspektrometritekniker och beräkningsverktyg relaterade till proteinsekvensering har bidragit till ökningen av det identifierade peptidertalet och peptidomer som karakteriseras. Peptidomiska studier analyserar ofta peptider som genereras naturligt i celler. Här beskrivs ett provberedningsprotokoll baserat på värmeinaktivering, vilket eliminerar proteasaktivitet och extraktion med milda förhållanden, så det finns ingen peptidbindning klyvning. Dessutom visas den relativa kvantiteten av peptider med stabil isotopmärkning genom reduktiv metylering av aminer. Denna märkningsmetod har vissa fördelar eftersom reagenserna är kommersiellt tillgängliga, billiga jämfört med andra, kemiskt stabila och möjliggör analys av upp till fem prover i en enda LC-MS-körning.
“Omics” vetenskaper kännetecknas av djup analys av en molekyluppsättning, såsom DNA, RNA, proteiner, peptider, metaboliter etc. Dessa genererade storskaliga datamängder (genomik, transkriptomik, proteomik, peptidomik, metabolomik, etc.) har revolutionerat biologin och lett till en avancerad förståelse av biologiska processer1. Termen peptidomics började introduceras i början av 1900-talet, och vissa författare har hänvisat till det som en gren av proteomik2. Peptidomik har dock distinkta särdrag, där huvudintresset är att undersöka det naturligt genererade peptideinnehållet under cellulära processer, liksom karakteriseringen av biologisk aktivitet hos dessa molekyler3,4.
Ursprungligen begränsades bioaktiva peptidstudier till neuropeptider och hormonpeptider genom Edman-nedbrytning och radioimmunoassay. Dessa tekniker tillåter dock inte en global analys, beroende på isoleringen av varje peptid i höga koncentrationer, tid för generering av antikroppar, förutom korsreaktivitetsmöjlighet5.
Peptidomics analys gjordes endast möjligt efter flera framsteg i flytande kromatografi kopplad masspektrometri (LC-MS) och genomprojekt som levererade omfattande datapooler för proteomik/peptidomik studier6,7. Dessutom behövde ett specifikt peptidextraktionsprotokoll för peptidomer fastställas eftersom de första studierna som analyserade neuropeptider globalt i hjärnprover visade att detektion påverkades av den massiva nedbrytningen av proteiner, som främst förekommer i denna vävnad efter 1 min obduktion. Förekomsten av dessa peptidfragment maskerade neuropeptidsignalen och representerade inte peptidome in vivo. Detta problem löstes främst med tillämpning av snabb uppvärmning inaktivering av proteaser med hjälp av mikrovåg bestrålning, vilket drastiskt minskade förekomsten av dessa artefakt fragment och tillät inte bara identifiering av neuropeptid fragment men avslöjade förekomsten av en uppsättning peptider från cytosoliska, mitokondriella och nukleära proteiner, olika av degradome6,8,9.
Dessa metodologiska förfaranden tillät en utvidgning av peptidom bortom de välkända neuropeptiderna, där hundratals intracellulära peptider som främst genereras av proteasomernas verkan har identifierats i jäst10, zebrafisk11, gnagare vävnader12 och mänskliga celler13. Dussintals av dessa intracellulära peptider har i stor utsträckning visat sig ha både biologiska och farmakologiska aktiviteter14,15. Dessutom kan dessa peptider användas som sjukdomsbiomarkörer och eventuellt ha klinisk betydelse, vilket visats i ryggmärgsvätskan från patienter med intrakraniell saccular aneurysms16.
För närvarande, förutom identifiering av peptidsekvenser, är det möjligt genom masspektrometri att erhålla data om absolut och relativ mängd. I den absoluta kvantiteten jämförs peptidnivåerna i ett biologiskt prov med syntetiska standarder, medan peptidnivåerna jämförs mellan två eller flera prover17 i den relativa kvantiteten. Relativ kvantitet kan utföras med följande metoder: 1) “etikettfri”18; 2) in vivo metabolisk märkning eller 3) kemisk märkning. De två sista är baserade på användningen av stabila isotopformer som ingår i peptider19,20. I etikettfri analys uppskattas peptidnivåerna med hänsyn till signalstyrkan (spektralantal) under LC-MS18. Isotopmärkning kan dock få mer exakta relativa nivåer av peptider.
Många peptidomiska studier använde trimetylammonium butyrat (TMAB) märkning reagenser som kemisk märkning, och på senare tid, Reduktiv metylering av amines (RMA) med deutererade och icke-deutererade former av formaldehyd och natrium cyanoborohydrid reagenser har använts11,21,22. TMAB-etiketterna är dock inte kommersiellt tillgängliga, och syntesprocessen är mycket mödosam. Å andra sidan, i RMA, reagenserna är kommersiellt tillgängliga, billiga jämfört med andra etiketter, förfarandet är enkelt att utföra och de märkta peptiderna är stabila23,24.
Användningen av RMA innebär att bilda en Schiff-bas genom att låta peptiderna reagera med formaldehyd, följt av en reduktionsreaktion genom cyanoborohydrid. Denna reaktion orsakar dimetylering av fria aminogrupper på N-terminaler och lysin sidokedjor och monometylater N-terminal prolines. Hur prolinrester ofta är sällsynta på N-terminalen, praktiskt taget alla peptider med fria aminer på N-ändstationen är märkta med två metylgrupper23,24,25.
I de flesta peptidomikstudier är ett av de kritiska stegen utan tvekan provberedningen som bör utföras noggrant för att undvika förekomst av peptidfragment som genereras av proteaser efter några minuter efter döden. De första studierna på hjärnextrakt som framställts av icke-mikrovågsprover visade att ett stort antal proteinfragment fanns i 10-kDa-mikrofiltraterna. Olika metoder har beskrivits för att undvika peptidspektra från proteinnedbrytning: fokuserad mikrovågsbestrålningsdjuroffer6,8, kryostatdisse…
The authors have nothing to disclose.
Utvecklingen och användningen av de tekniker som beskrivs här stöddes av Brasiliens nationella forskningsråds anslag 420811/2018-4 (LMC); Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) bidrag 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) och 21/01286-1 (MEME). Finansiärerna hade ingen roll i studiens utformning, datainsamling och analys, beslut att publicera eller förbereda artikeln.
10 kDa cut-off filters | Merck Millipore | UFC801024 | Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrane, 10 kDa |
Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 11213 | |
analytical column (EASY-Column) | EASY-Column | (SC200) | 10 cm, ID75 µm, 3 µm, C18-A2 |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | MS-222 |
Fluorescamine | Sigma-Aldrich | F9015 | |
Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | 252549 | |
Formaldehyde-13C, d2, solution | Sigma-Aldrich | 596388 | |
Formaldehyde-d2 solution | Sigma-Aldrich | 492620 | |
Formic acid | Sigma-Aldrich | 33015 | |
Fume hood | Quimis | Q216 | |
Hydrochloric acid – HCl | Sigma-Aldrich | 258148 | |
LoBind-Protein retention tubes | Eppendorf | EP0030108116-100EA | |
LTQ-Orbitrap Velos | Thermo Fisher Scientific | LTQ Velos | |
Microwave oven | Panasonic | NN-ST67HSRU | |
n Easy-nLC II nanoHPLC | Thermo Fisher Scientific | LC140 | |
PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions Inc. | VERSION 8.5 | |
Phosphate-buffered saline | Invitrogen | 3002 | tablets |
precolumn (EASY-Column) | Thermo Fisher Scientific | (SC001) | 2 cm, ID100 µm, 5 µm, C18-A1 |
Refrigerated centrifuge | Hermle | Z326K | for conical tubes |
Refrigerated centrifuge | Vision | VS15000CFNII | for microtubes |
Reversed-phase cleanup columns (Oasis HLB 1 cc Cartridge) | Waters | 186000383 | Oasis HLB 1 cc Cartridge |
Sodium cyanoborodeuteride – NaBD3CN | Sigma-Aldrich | 190020 | |
Sodium cyanoborohydride – NaBH3CN | Sigma-Aldrich | 156159 | |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | NOTE: 0.2 M PB= 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (26.85 mL of Na2HPO3 1M) plus 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (23.15 mL of NaH2PO3 1M) to 250 ml of water |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S3139 | |
Sonicator | Qsonica | Q55-110 | |
Standard peptide | Proteimax | amino acid sequence: LTLRTKL | |
Triethylammonium buffer – TEAB 1 M | Sigma-Aldrich | T7408 | |
Trifluoroacetic acid – TFA | Sigma-Aldrich | T6508 | |
Ultra purified water | Milli-Q | Direct-Q 3UV | |
Vacuum centrifuge | GeneVac | MiVac DNA concentrator | |
Water bath | Cientec | 266 | |
Xcalibur Software | ThermoFisher Scientific | OPTON-30965 |