JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

Farede Gelişmekte Olan Yumurtalık Rezervinin Kantitatif 3D Analizi için Tüm Yumurtalık İmmünofloresansı, Temizleme ve Multifoton Mikroskobu

Published: September 03, 2021
doi:
10.3791/62972
, , ,
1The Jackson Laboratory

Summary

Burada, tam montajlı immünoboyama, çoklu foton mikroskobu ve 3D görselleştirme ve analiz kullanarak kantitatif ve kalitatif analizler için tüm yumurtalıkları görüntülemek için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, toksikoloji, klinik teşhis ve yumurtalık fonksiyonunun genomik tahlilleri için geçerli olan yüksek verimli, güvenilir ve tekrarlanabilir işlemeyi kapsar.

Abstract

Kadın fertilitesi ve üreme ömrü, yumurtalık oosit rezervinin kalitesine ve miktarına bağlıdır. Mayotik faz I’e giren dişi germ hücrelerinin tahmini% 80’i, Fetal Oosit Yıpranması (FOA) ve doğum sonrası yaşamın ilk haftasında elimine edilir. Üç ana mekanizma, gelişim sırasında hayatta kalan oosit sayısını düzenler ve ergenliğe giren kadınlarda yumurtalık rezervini oluşturur. Yumurta kaybının ilk dalgasında, oositlerin% 30-50’si, yüksek Uzun serpiştirilmiş nükleer element-1 (LINE-1) ekspresyonuna atfedilen bir fenomen olan erken FOA sırasında elimine edilir. Oosit kaybının ikinci dalgası, mayotik defekti olan oositlerin mayotik kalite kontrol noktası ile ortadan kaldırılmasıdır. Oosit kaybının üçüncü dalgası, primordiyal folikül oluşumu sırasında, bazı oositlerin folikül oluşturamadığı durumlarda perinatal olarak ortaya çıkar. Bu üç oosit kaybı dalgasının her birini neyin düzenlediği ve farelerde veya insanlarda yumurtalık rezervini nasıl şekillendirdikleri belirsizliğini korumaktadır.

İmmünofloresan ve 3D görselleştirme, oosit gelişimini daha az bilgilendirici 2D bölümlerden ziyade tüm yumurtalık bağlamında görüntülemek ve analiz etmek için yeni bir yol açmıştır. Bu makale, tüm yumurtalık immün boyama ve optik temizleme için kapsamlı bir protokol sunarak, multifoton mikroskobu kullanarak görüntüleme ve ticari olarak temin edilebilen yazılımı kullanarak 3D modelleme için preparatlar sunmaktadır. Bu yöntemin C57BL / 6J farelerde yumurtalık gelişimi sırasında yumurta yıpranmasının dinamiklerini göstermek ve üç yumurta eliminasyon dalgası sırasında yumurta kaybını ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Bu protokol, oosit görselleştirme ve nicelleştirme için prenatal ve erken postnatal yumurtalıklara ve diğer kantitatif yaklaşımlara uygulanabilir. Daha da önemlisi, protokol, toksikoloji, klinik teşhis ve yumurtalık fonksiyonunun genomik tahlillerindeki ihtiyaçları karşılayabilecek yüksek verimli, güvenilir ve tekrarlanabilir işlemeyi barındırmak için stratejik olarak geliştirilmiştir.

Introduction

Çoğu memeli dişi, primordiyal foliküllerde depolanan ve yumurtalık rezervini (OR) oluşturan sınırlı sayıda mayotik olarak tutuklanmış oositle doğar1,2. Ameliyathane, genel kadın üreme ömrünü ve sağlığını belirler3. Ameliyathane normalde yaşlanma ile birlikte küçülür ve bazı genotoksik ajanlara (radyasyon / kemoterapi) ve çevresel streslere (yetersiz beslenme) maruz kalındığında erken tükenebilir ve bu da infertiliteye yol açar 4,5,6. İdiyopatik kadın infertilitesi sıklıkla ameliyathaneden gelişen yumurtaların genetik ve fizyolojik kalitesine bağlanabilir ve hala tam olarak anlaşılamamıştır 7,8. Kadın folikül bağışı büyük ölçüde doğumla önceden belirlendiğinden, ameliyathanenin kurulması ve sürdürülmesinde yer alan düzenleyici mekanizmaları anlamak önemlidir.

Farelerde, OR oluşumu, Embriyonik gün (E) 7.52 civarında ilkel germ hücrelerinin (PGC’ler) spesifikasyonu ile başlar. PGC’ler genital sırtlara göç eder ve burada yaklaşık E10.59 tarafından ikamet ederler. Aşağıdaki yaygın proliferasyon, tamamlanmamış sitokinezi ile ortaya çıkar ve daha sonra gelişme10,11’de parçalanacak kistlerin oluşumuna neden olur. Yaklaşık E12.5’te gonadal cinsiyet belirlenir ve PGC proliferasyonu yumurtalıklarda durur. Kadınlarda, PGC’ler, şimdi oositler, yaklaşık E13.512,13’te mayotik faz I’e (MPI) girerler. Oositler uzatılmış MPI ile ilerler ve doğum sırasında diktiyat aşamasında tutuklanır. Doğumdan sonraki ilk hafta boyunca, tutuklanan her oosit granüloza hücreleri ile çevrilidir, böylece ilkel bir folikül oluşturur.

Bir dişinin ameliyathanesindeki primordiyal foliküllerin sayısı, MPI tutuklamasından önce ve sırasında apoptoz, otofaji veya nekroz yoluyla meydana gelen oosit eliminasyon dalgalarından kaç oositin kurtulduğuna bağlıdır14,15. İlk dalga fetal gelişim sırasında ortaya çıkar ve FOA olarak bilinir. FOA, dişilerde (memeli ve memeli olmayan) evrimsel olarak korunmuş bir süreçtir ve bu sayede yumurta türlerinin tahmini% 50-80’i dişi türlere bağlı olarak elimine edilir16,17,18,19. Farelerde, FOA E15.5 ila E18.5 arasında meydana gelir ve oosit ölümüne neden olan retrotranspozon LINE-1 sekanslarının reaktivasyonu ve ekspresyonuna atfedilmiştir20,21. Oosit eliminasyonunun ikinci dalgası, onarılmamış DNA çift iplikçik kırılmaları (DSB’ler) gibi mayotik defektlere sahip oositleri ortadan kaldıran mayotik bir kontrol noktasından gerçekleşir22,23. Bir sonraki oosit eliminasyon dalgası, kist parçalanması sırasında meydana gelir ve her biri tek bir oosit10,11,24,25 içeren ilkel foliküllerin oluşumu sırasında doruğa ulaşır.

Farelerde, ilkel folikül rezervi büyük ölçüde ergenlik döneminde kurulur, daha sonra ilkel foliküller düzenli üreme döngüleri sırasında büyüme için aktive edildikçe azalır. Ameliyathane büyüklüğü bireysel kadınlar arasında ve farelerin farklı genetik suşları arasında değişir; Ancak, ameliyathane büyüklüğünün genetik regülasyonu iyi anlaşılmamıştır26,27,28,29. Ameliyathane regülasyonunun genetik çalışmaları, doğum öncesi ve doğum sonrası gelişim sırasında oosit eliminasyon dalgalarını incelemek için standartlaştırılmış protokollerin eksikliği nedeniyle engellenmektedir. Farelerde çeşitli oosit niceleme metodolojileri geliştirilmiştir, bunların en yaygın ve yaygın olarak kullanılanı histolojik kesitlerin histomorfometrik değerlendirilmesidir30,31. Bu teknikte oositler, hematoksilin ve eozin (H&E) ve periyodik asit-Schiff (PAS) veya floresan belirteçler gibi histolojik lekelere sahip seri kesitlerde tanımlanır. Bu teknik, kesit kalınlığı, yumurtalık boyunca tüm bölümlerin verimli bir şekilde geri kazanılması ve bireysel laboratuvarların sayım şemaları dahil olmak üzere tüm koşullar sabit kalırsa güvenilirdir. Bununla birlikte, farklı laboratuvarlar tarafından bildirilen sayılar genellikle önemli ölçüde farklılık gösterir ve bu nedenle kolayca karşılaştırılamaz.

Ayrıca, genetik farklılıklar göz önüne alındığında, farklı fare suşlarının kullanımı da yumurta sayımlarını etkileyebilir. Histomorfometrik değerlendirme için ek hesaplamalı yaklaşımlar geliştirilmiştir ve fraksiyonatör yaklaşımını kullanarak oositlerin otomatik tespitini, hesaplamalı algoritmaları kullanarak otomatik sayımı ve aynı oositin birden fazla sayımını önlemek için histolojik görüntülerin 3D rekonstrüksiyonunu içerir31,32,33,34,35,36 . Histomorfometrik değerlendirmeye eklenen bu iyileştirmelerle bile, teknik, özellikle büyük ölçekli ve yüksek verimli çalışmalar için nispeten emek yoğundur. Toplanan veriler, sayım şemaları, bilgisayar algoritmaları ve kullanılan yazılımlardaki farklılıklar nedeniyle çalışmalar arasında tekrarlanabilir ve karşılaştırılabilir olmayabilir.

Son zamanlarda, yeni orta çözünürlüklü multifoton ve ışık tabakası mikroskobu ve optik doku temizleme yöntemlerinin geliştirilmesiyle hızlanan bozulmamış yumurtalıklar için 3D modelleme ve analiz teknikleri, yumurta sayılarını verimli bir şekilde ölçmek ve protein lokalizasyonunu ve dinamiklerini incelemek için tercih edilen yöntem haline gelmektedir37,38. Bu 3D yöntemler, dokular ve organlar daha iyi korunduğu ve bozulmadan tutulduğu için histolojik yöntemlere kıyasla tipik olarak avantajlıdır. Ayrıca, 3D analiz ve modelleme, 2D analizde kaçırılabilecek organ içindeki hücre nişleri veya alt yapıları içindeki ve arasındaki işlev ve etkileşimler hakkında ek bilgiler sağlar.

Tüm organların 3D analizi, yumurtalıklar gibi bireysel organlar için doku bozulması veya hasarı olmadan fiksasyon, immün boyama ve optik temizleme protokollerinin optimizasyonunu gerektirir. Yüksek çözünürlüklü mikroskopi için görüntüleme için numune montajının ek optimizasyonu gereklidir ve mevcut görüntüleme platformuna bağlı olabilir. Son olarak, tüm bozulmamış yumurtalığın görüntülenmesi, sonraki hesaplamalı analizler için büyük miktarda veri üretir. Bu nedenle, karşılaştırmalı çalışmalar için ve gelişim aşamaları boyunca oositlerin sayımı için standartlaştırılmış 3D yöntemler geliştirmeye ihtiyaç vardır.

Bu protokol, standart immünoboyama ve daha önce bildirilen temizleme protokollerini kullanır ve basit, kullanıcı dostu ve yüksek verimli bir yaklaşıma odaklanır 38,39,40,41. Protokol, doğum sonrası 28. güne (P28) kadar çok sayıda doğum öncesi ve doğum sonrası yumurtalıkları ve farklı fare genetik geçmişlerinden gelen farklı boyutlardaki yumurtalıkları analiz etmek için optimize edilmiştir. İmmün boyama adımları tüm aşamalar için benzerdir; Bununla birlikte, temizleme protokolleri daha büyük boyutları, küçük ve büyük yumurtalıklar için sırasıyla 40,41 olan ScaleS4 (0) ve CUBIC nedeniyle pubertal yumurtalıklar için farklılık göstermektedir. Ayrıca, kan hücrelerinden otofloresan önlemek için fiksasyondan önce P28 farelerde tüm vücut perfüzyonu gerçekleştirilir. Görüntü elde etmek için ışık tabakası mikroskobuna alternatif olarak Leica DIVE/4Tune platformu üzerine çok fotonlu mikroskop inşa edildi ve bu protokol için çeşitli analitik araçlara sahip IMARIS 3D Görselleştirme ve Analiz yazılımı seçildi. Bu protokolün takip edilmesi kolaydır ve daha az pratiktir, bu nedenle zaman kazandırır. Ayrıca, yumurtalığın büyüklüğüne ve yumurtaların düzenlenmesine bağlı olarak yumurta miktarı nispeten hızlıdır.

Protocol

Kullanılan tüm fareler C57BL/6J genetik suşu içerisindeydi (bakınız Malzeme Tablosu). Bu suş tamamen sıralanmıştır ve yumurtalık yapısı ve fonksiyonu ile ilgili birçok çalışma için standarttır. Fareler NIH kurallarına göre barındırıldı ve yapılan prosedürler Jackson Laboratuvarı Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Bu protokolde kullanılan reaktifler ve bileşimler sırasıyla Malzeme Tablosu ve Tablo 1’de…

Representative Results

Tüm yumurtalığın immün boyanması ve görüntülenmesi, aynı teknik ve belirteçler kullanılarak farklı gelişim evrelerinde yumurtalıklardaki oositlerin veya protein ekspresyonunun görüntülenmesini ve nicelleştirilmesini sağlar (Şekil 3). Bu protokol, yumurtalıkların birden fazla aşamada ve birden fazla fare suşundan analizinin gerekli olduğu büyük ölçekli bir proje için geliştirilmiştir. Burada, genetik analiz için standart bir suş olan C57BL6 / J suşu için t…

Discussion

Bu makalede, germ hücresi niceliği ve protein lokalizasyonu için yüksek verimli ve karşılaştırmalı çalışmalar için prenatal ve postnatal yumurtalıklar için ayrıntılı bir 3D immünoboyama ve görüntüleme protokolü sunulmaktadır. Bu protokolü, yumurtalıklardaki oosit sayılarını (N = 6-12), 2-4 24 kuyucuklu plakanın tipik olarak bir seferde işlendiği 10-16 farklı suştaki altı gelişimsel zaman noktasında analiz etmek için geliştirdik. Bu yöntem diğer organlar veya hücresel belirteçler…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri hibeleri (R01 HD093778 ila E.B-F ve T32 HD007065 ila R.B) tarafından desteklenmiştir. Zachary Boucher’e radyasyon deneyindeki yardımları için teşekkür ederiz. Mary Ann Handel’e yazıyı eleştirel bir şekilde okuduğu için teşekkür ederiz. Sonia Erattupuzha’nın ve Jackson Laboratuvarı’ndaki Mikroskopi Çekirdek Servisi’nin bu yayında açıklanan mikroskopi çalışmasında uzman yardımı için katkılarını ve Jackson Laboratuvarı’ndaki Bilimsel Enstrüman Hizmetleri’nden Jarek Trapszo’yu 3D baskılı adaptör slaytını tasarladığı için minnetle kabul ediyoruz.

Materials

Benchtop Incubator Benchmark Scientific H2200-H 37 °C incubator
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 97061-416
C57BL/6J The Jackson Laboratory 000664 mouse inbred strain
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D1435 Hazardous material
D-Sorbitol Sigma-Aldrich S6021
Dumont #5 Forceps FST 91150-20
FastWells Reagent Barriers GraceBio 664113 Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well)
Fine Scissors FST 91460-11
Glycerol Sigma-Aldrich G2025
Glycine ThermoFisher Scientific BP381-500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A-21246 Dilution 1:1000
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A-21434 Dilution 1:1000
Goat serum Sigma-Aldrich G9023
IMARIS Software Oxford Instruments Version 9.7.0 Image visualization and analysis software
Insight X3 Spectra-Physics InSight X3 Tunable Ultrafast Laser Laser for Multiphoton Imaging
LASX software Leica Version 3.5.6 Image acquisition software
Leica DIVE/4TUNE/FALCON Leica Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406 Multiphoton Microscope
MaiTai HP Spectra-Physics Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser Laser for Multiphoton Imaging
Masterflex Pump Controller SPW Industrial Model: 7553-50 Peristaltic pump for perfusion
Mayo Scissors FST 14010-17 5” –7” blunt/blunt scissors for decapitation
Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm VWR 48366-249
Mini BioMixer Benchmark Scientific B3D1020 shaker/nutator for 37 °C incubator
Nikon Ergonomic SMZ1270 Leica  SMZ1270 stereomicroscope
Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution) Electron Microscopy Sciences 15710 Hazardous material
PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline ThermoFisher Scientific BP2944100 Dissolve in Milli-Q water
Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution ThermoFisher Scientific ICN1670249
Polyvinyl alcohol (PVA) Sigma-Aldrich P8136
Quadrol (N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine) Sigma-Aldrich 122262
Rabbit anti-DDX4/MVH Abcam ab27591 Dilution 1:500
Rabbit anti-LINE-1 ORF1p Abcam ab216324 Dilution 1:500
Rat anti-TRA98/GCNA Abcam ab82527 Dilution 1:500
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 Hazardous material
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 Hazardous material
Sucrose ThermoFisher Scientific S0389
Tekmar Orbital Shaker Bimedis VXR-S10 shaker for room temperature
Triethanolamine Sigma-Aldrich 90279
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
UNOLOK Infusion Set MYCO Medical 7001-23 needles for perfusion
Urea Amresco 97061-920
X-Cite 120LED Excelitas S/N XT640-W-0147 low-power LED fluorescence lamp
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelosi, E., Forabosco, A., Schlessinger, D. Genetics of the ovarian reserve. Frontiers in Genetics. 6, 308 (2015).
  2. Pepling, M. E. From primordial germ cell to primordial follicle: mammalian female germ cell development. Genesis. 44 (12), 622-632 (2006).
  3. Wilkosz, P., Greggains, G. D., Tanbo, T. G., Fedorcsak, P. Female reproductive decline is determined by remaining ovarian reserve and age. PLoS One. 9 (10), 108343 (2014).
  4. Richardson, M. C., Guo, M., Fauser, B. C. J. M., Macklon, N. S. Environmental and developmental origins of ovarian reserve. Human Reproduction Update. 20 (3), 353-369 (2014).
  5. Spears, N., et al. Ovarian damage from chemotherapy and current approaches to its protection. Human Reproduction Update. 25 (6), 673-693 (2019).
  6. Morgan, S., Anderson, R. A., Gourley, C., Wallace, W. H., Spears, N. How do chemotherapeutic agents damage the ovary. Human Reproduction Update. 18 (5), 525-535 (2012).
  7. Wesevich, V., Kellen, A. N., Pal, L. Recent advances in understanding primary ovarian insufficiency. F1000Research. 9, (2020).
  8. Biswas, L., et al. Meiosis interrupted: the genetics of female infertility via meiotic failure. Reproduction. 161 (2), 13-35 (2021).
  9. Tam, P. P., Snow, M. H. Proliferation and migration of primordial germ cells during compensatory growth in mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 64, 133-147 (1981).
  10. Pepling, M. E., Spradling, A. C. Female mouse germ cells form synchronously dividing cysts. Development. 125 (17), 3323-3328 (1998).
  11. Pepling, M. E., Spradling, A. C. Mouse ovarian germ cell cysts undergo programmed breakdown to form primordial follicles. Developmental Biology. 234 (2), 339-351 (2001).
  12. Adams, I. R., McLaren, A. Sexually dimorphic development of mouse primordial germ cells: switching from oogenesis to spermatogenesis. Development. 129 (5), 1155-1164 (2002).
  13. McLaren, A., Southee, D. Entry of mouse embryonic germ cells into meiosis. Developmental Biology. 187 (1), 107-113 (1997).
  14. Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. How is the number of primordial follicles in the ovarian reserve established. Biology of Reproduction. 93 (5), 111 (2015).
  15. Tilly, J. L. Commuting the death sentence: how oocytes strive to survive. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 2 (11), 838-848 (2001).
  16. Baker, T. G. A quantitative and cytological study of germ cells in human ovaries. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 158, 417-433 (1963).
  17. Baker, T. G. A quantitative and cytological study of oogenesis in the rhesus monkey. Journal of Anatomy. 100, 761-776 (1966).
  18. Kurilo, L. F. Oogenesis in antenatal development in man. Human Genetics. 57 (1), 86-92 (1981).
  19. Matova, N., Cooley, L. Comparative aspects of animal oogenesis. Developmental Biology. 231 (2), 291-320 (2001).
  20. Malki, S., vander Heijden, G. W., O’Donnell, K. A., Martin, S. L., Bortvin, A. A role for retrotransposon LINE-1 in fetal oocyte attrition in mice. Developmental Cell. 29 (5), 521-533 (2014).
  21. Tharp, M. E., Malki, S., Bortvin, A. Maximizing the ovarian reserve in mice by evading LINE-1 genotoxicity. Nature Communications. 11 (1), 330 (2020).
  22. Rinaldi, V. D., Bolcun-Filas, E., Kogo, H., Kurahashi, H., Schimenti, J. C. The DNA damage checkpoint eliminates mouse oocytes with chromosome synapsis failure. Molecular Cell. 67 (6), 1026-1036 (2017).
  23. Bolcun-Filas, E., Rinaldi, V. D., White, M. E., Schimenti, J. C. Reversal of female infertility by Chk2 ablation reveals the oocyte DNA damage checkpoint pathway. Science. 343 (6170), 533-536 (2014).
  24. Pepling, M. E. Follicular assembly: mechanisms of action. Reproduction. 143 (2), 139-149 (2012).
  25. Tingen, C., Kim, A., Woodruff, T. K. The primordial pool of follicles and nest breakdown in mammalian ovaries. Molecular Human Reproduction. 15 (12), 795-803 (2009).
  26. Wallace, W. H. B., Kelsey, T. W. Human ovarian reserve from conception to the menopause. PLoS One. 5 (1), 8772 (2010).
  27. Pepling, M. E., et al. Differences in oocyte development and estradiol sensitivity among mouse strains. Reproduction. 139 (2), 349-357 (2010).
  28. Nelson, S. M., Anderson, R. A. Prediction of premature ovarian insufficiency: foolish fallacy or feasible foresight. Climacteric. , 1-10 (2021).
  29. Wood, M. A., Rajkovic, A. Genomic markers of ovarian reserve. Seminars in Reproductive Medicine. 31 (6), 399-415 (2013).
  30. Tilly, J. L. Ovarian follicle counts–not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
  31. Winship, A. L., Sarma, U. C., Alesi, L. R., Hutt, K. J. Accurate follicle enumeration in adult mouse ovaries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (164), e61782 (2020).
  32. Fiorentino, G., Parrilli, A., Garagna, S., Zuccotti, M. Three-dimensional imaging and reconstruction of the whole ovary and testis: a new frontier for the reproductive scientist. Molecular Human Reproduction. 27 (3), 007 (2021).
  33. Sarma, U. C., Winship, A. L., Hutt, K. J. Comparison of methods for quantifying primordial follicles in the mouse ovary. Journal of Ovarian Research. 13 (1), 121 (2020).
  34. Skodras, A., Marcelli, G. Computer-generated ovaries to assist follicle counting experiments. PLoS One. 10 (3), 0120242 (2015).
  35. Sonigo, C., et al. High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach. Scientific Reports. 8 (1), 13499 (2018).
  36. Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G. M., Ebling, F. J. P., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
  37. Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).
  38. Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E., Schimenti, J. C. Pharmacological inhibition of the DNA damage checkpoint prevents radiation-induced oocyte death. Genetics. 206 (4), 1823-1828 (2017).
  39. Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice. Biology of Reproduction. 93 (5), 113 (2015).
  40. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  41. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
  42. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
  43. Microscope slide (25×75) with inset for coverslips (22×22). NIH 3D Print Exchange. Capel Lab at Duke University Medical Center Available from: https://3dprint.nih.gov/discover/3DPX-009765 (2018)
  44. Niu, W., Spradling, A. C. Two distinct pathways of pregranulosa cell differentiation support follicle formation in the mouse ovary. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (33), 20015-20026 (2020).
  45. Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -. J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis. Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).
  46. Carroll, J., Marangos, P. The DNA damage response in mammalian oocytes. Frontiers in genetics. 4, 117 (2013).
  47. McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovary. Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).
  48. McKey, J., Anbarci, D. N., Bunce, C., Capel, B. Integration of mouse ovary morphogenesis with developmental dynamics of the oviduct, ovarian ligaments, and rete ovarii. bioRxiv. , (2021).
  49. Udan, R. S., Piazza, V. G., Hsu, C. -. W., Hadjantonakis, A. -. K., Dickinson, M. E. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141 (22), 4406-4414 (2014).
  50. Di Giovanna, A. P., et al. Tailored sample mounting for light-sheet fluorescence Microscopy of clarified specimens by polydimethylsiloxane casting. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 35 (2019).

Tags

Whole OvaryImmunofluorescenceClearingMultiphoton Microscopy3D AnalysisOvarian ReserveMouseGerm CellsOvarian DevelopmentPerfusionParaformaldehydeImmunostaining
check_url/62972?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Boateng, R., Boechat, N., Henrich, P. P., Bolcun-Filas, E. Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse. J. Vis. Exp. (175), e62972, doi:10.3791/62972 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image