Deux méthodes de peeling pour l’isolement des compartiments des cellules photoréceptrices dans la rétine de la souris pour l’analyse des protéines

Summary

Ce protocole présente deux techniques pour isoler les compartiments subcellulaires des photorécepteurs de bâtonnets murins pour l’analyse des protéines. La première méthode utilise de la rétine vivante et du papier filtre de cellulose pour séparer les segments extérieurs des tiges, tandis que la seconde utilise de la rétine lyophilisée et du ruban adhésif pour décoller les couches internes et externes des segments.

Abstract

Les photorécepteurs de bâtonnets sont des neurones sensoriels hautement polarisés avec des compartiments distincts. Les bâtonnets de souris sont longs (~80 μm) et minces (~2 μm) et sont emballés latéralement dans la couche la plus externe de la rétine, la couche photoréceptrice, ce qui entraîne l’alignement de compartiments subcellulaires analogues. Traditionnellement, la section tangentielle de la rétine plate gelée a été utilisée pour étudier le mouvement et la localisation des protéines dans différents compartiments de tiges. Cependant, la courbure élevée de la rétine de souris à dominante bâtonnet rend la section tangentielle difficile. Motivés par l’étude du transport des protéines entre les compartiments, nous avons développé deux méthodes de peeling qui isolent de manière fiable le segment externe de la tige (ROS) et d’autres compartiments subcellulaires pour les transferts occidentaux. Nos techniques relativement rapides et simples fournissent des fractions enrichies et spécifiques aux subcellulaires pour mesurer quantitativement la distribution et la redistribution de protéines photoréceptrices importantes dans des bâtonnets normaux. De plus, ces techniques d’isolement peuvent également être facilement adaptées pour isoler et étudier quantitativement la composition protéique d’autres couches cellulaires dans la rétine saine et dégénérée.

Introduction

Les cellules photoréceptrices en bâtonnets, étroitement emballées dans la couche la plus externe de la rétine neurale, font partie intégrante de la vision en basse lumière. Pour fonctionner comme des compteurs de photons fidèles, les bâtonnets utilisent une voie de signalisation à base de protéine G, appelée phototransduction, pour générer des réponses rapides, amplifiées et reproductibles à la capture de photons uniques. Cette réponse à la lumière déclenche finalement un changement du courant au niveau de la membrane plasmique et est ensuite signalée au reste du système ^visuel1. Comme leur nom l’indique, chaque cellule de bâtonnet a une forme distincte en forme de bâtonnet et présente une morphologie cellulaire hautement polarisée, composée d’un segment externe (OS), d’un segment interne (IS), d’un corps cellulaire (CB) et d’un terminal synaptique (ST). Chaque compartiment subcellulaire a une machinerie protéique spécifique (liée à la membrane et soluble), des caractéristiques biomoléculaires et des complexes protéiques qui jouent des rôles cruciaux tels que la phototransduction visuelle, l’entretien ménager général et la synthèse des protéines, et la transmission ^{synaptique2,3}.

Il y a plus de 30 ans, le mouvement réciproque dépendant de la lumière des protéines subcellulaires, en particulier la transducine (loin de l’OS) et l’arrestine (vers l’OS), a été observé pour la première fois4,5,6,7. Très tôt, ce phénomène observé a été accueilli avec scepticisme, en partie à cause de la vulnérabilité de l’immunohistochimie au masquage de l’épitope8. Au début des années 2000, la translocation des protéines dépendantes des stimuli a été confirmée à l’aide d’une technique de sectionnement physique rigoureuse et ^ardue9. La section tangentielle en série de la rétine de rongeurs congelée montée à plat, suivie d’une immunobuvardage, a révélé que la transducine9,10, l’arrestine11,12 et la ^recoverine13 subissent toutes une redistribution subcellulaire en réponse à la lumière. On pense que la translocation par la lumière de ces protéines de signalisation clés régule non seulement la sensibilité de la cascade de phototransduction9,14,15, mais peut également être neuroprotectrice contre les dommages causés par la lumière16,17,18. Parce que le transport des protéines entraîné par la lumière dans les bâtonnets semble être très important pour la biologie et la physiologie des cellules des bâtonnets, les techniques qui permettent l’isolement de différents compartiments subcellulaires pour déterminer la distribution des protéines sont des outils de recherche précieux.

Actuellement, il existe quelques méthodes visant à isoler les compartiments subcellulaires des tiges. Cependant, ces méthodes peuvent être longues et difficiles à reproduire, ou nécessiter une quantité importante d’isolat rétinien. Les préparations de segment externe de tige (ROS) par centrifugation par gradient de ^densité19, par exemple, sont couramment utilisées pour séparer les ROS de l’homogénat rétinien. Cette méthode est largement utilisée pour le transfert western, mais la procédure prend beaucoup de temps et nécessite un minimum de 8 à 12 rétines ^murines20. D’autre part, la section tangentielle en série de la rétine murine et ratie congelée a été mise en œuvre avec succès pour isoler le système d’exploitation, l’IS, le CB et le ST9,11,13. Cependant, cette méthode est techniquement difficile en raison de la nécessité d’aplatir complètement la petite rétine murine très incurvée pour aligner les couches rétiniennes avant la section tangentielle. Puisqu’il existe une pléthore de modèles murins et de souris transgéniques récapitulant les maladies du système visuel, la création d’une technique qui sépare de manière fiable, rapide et facile les compartiments individuels des tiges est prometteuse en révélant les processus physiologiques qui se produisent dans chaque compartiment spécialisé et les mécanismes qui sous-tendent les processus visuels de santé et de maladie.

Pour faciliter ces recherches, nous décrivons deux méthodes de peeling qui isolent les compartiments subcellulaires des bâtonnets plus facilement que les protocoles actuels. La première méthode de peeling, adaptée d’une technique d’exposition de cellules bipolaires marquées par fluorescence pour l’enregistrement de la pince de ^patch21, utilise du papier filtre de cellulose pour éliminer séquentiellement le ROS d’une rétine murine vivante et isolée (Figure 1). La deuxième méthode, adaptée d’une procédure qui isole les trois couches primaires de cellules rétiniennes d’une rétine de ^poussin22 et de ^grenouille23, utilise du ruban adhésif pour enlever le ROS et le segment interne de la tige (RIS) d’une rétine lyophilisée (Figure 2). Les deux procédures peuvent être complétées en 1 h et sont considérablement conviviales. Nous fournissons une validation de l’efficacité de ces deux protocoles de séparation pour le transfert western en utilisant des rétines adaptées à l’obscurité et exposées à la lumière de souris C57BL / 6J pour démontrer la translocation induite par la lumière de la transducine en bâtonnet (GNAT1) et de l’arrestine (ARR1). De plus, en utilisant la méthode du peeling sur bande, nous fournissons des preuves supplémentaires que notre technique peut être utilisée pour examiner et corriger les incohérences entre les données de localisation des protéines acquises par l’immunocytochimie (ICC) et les transferts de Western. Plus précisément, notre technique a montré que: 1) l’isoforme de la protéine kinase C-alpha (PKCα) est présente non seulement dans les cellules bipolaires, mais aussi dans les ROS et RIS murins, bien qu’à de faibles ^{concentrations24,25} et 2) la rhodopsine kinase (GRK1) est présente principalement dans l’échantillon isolé de SG. Ces données démontrent l’efficacité de nos deux techniques de peeling pour séparer et quantifier des protéines spécifiques de bâtonnets et de rétine.

Protocol

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles locales du comité de recherche sur les soins aux animaux de l’Université de Californie du Sud (USC). 1. Méthode de peeling de la rétine à cellules vivantes Préparation des tampons d’Ames, des papiers à peler et du plat de dissection À l’aide de ciseaux à iris à pointe émoussée (ou d’un type de ciseau équivalent), découpez le papier filtre en cell…

Representative Results

Les stratégies actuelles ont été développées pour fournir des méthodes relativement rapides et simples pour isoler et analyser des protéines parmi des compartiments subcellulaires de bâtonnets spécifiques pour l’analyse par transfert de Western. Nous avons appliqué deux techniques de peeling séquentiel (Figure 1 et Figure 2) suivies d’immunoblotting pour démontrer que ces méthodes pouvaient être utilisées de manière fiable pour détecter la d…

Discussion

De nombreuses maladies de la rétine affectent les cellules photoréceptrices des bâtonnets, entraînant la mort des bâtonnets et, en fin de compte, une perte de vision ^complète37. Une partie importante des origines génétiques et mécanistes de la dégénérescence rétinienne humaine ont été récapitulées avec succès dans de nombreux modèles murins au fil des ans. Dans ce contexte, la capacité de séparer facilement et sélectivement les compartiments subcellulaires individuels des bâ…

Materials

100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter	N/A	N/A
100% O2 tank	N/A	N/A
1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 μm	Genesee Scientific	25-235
4X SDS Sample Buffer	Millipore Sigma	70607-3
50 mL Falcon tube	Fisher Scientific	14-432-22
95% O2 and 5% CO2 tank	N/A	N/A
Ames’ Medium with L-glutamine, without bicarbonate	Sigma-Aldrich	A1420
CaCl2 (99%, dihydrate)	Sigma	C-3881
Drierite (Anhydrous calcium sulfate, >98% CaSO4, >2% CoCl2)	WA Hammond Drierite Co LTD	21005
Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm)	Falcon-Corning	08-757-100A
Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm)	Falcon-Corning	08-772F
Feather Scalpel (No. 10, 40 mm)	VWR	100499-578
Feather Scalpel (No. 11, 40 mm)	VWT	100499-580
KCl (99%)	Sigma	P-4504
Kimble Kontes pellet pestle	Sigma	z359971
Labconco Fast-Freeze Flasks	Labconco	N/A
LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask	N/A	N/A
MgCl2	Sigma	M-9272
Milli-Q/de-ionized water	EMD Millipore	N/A
Na2HPO4 (powder)	J.T. Baker	4062-01
NaCl (crystal)	EMD Millipore	Sx0420-3
NaHCO3	Amresco	0865
OmniPur EDTA	EMD	4005
OmniPur HEPES, Free Acid	EMD	5320
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793
Reynolds Wrap Aluminum Foil	Reynolds Brands	N/A
Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m)	Scotch-3M	N/A
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D67501
Spectrafuge mini centrifuge	Labnet International, Inc	C1301
Tissue incubation chamber (purchased or custom made)	N/A	N/A
Tris-HCl	J.T.Baker	4103-02
Triton X-100	Signma-Aldrich	T8787
VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine	SP Scientific	N/A
VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm)	VWR	28310-015
Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 μm)	Whatman/GE Healthcare	1001-090
Wide bore transfer pipet, Global Scientific	VWR	76285-362