שתי שיטות פילינג לבידוד תאי קולטני אור ברשתית העכבר לניתוח חלבונים
Summary
פרוטוקול זה מציג שתי טכניקות לבודד את התאים התת-תאיים של קולטני מוט מורין לניתוח חלבונים. השיטה הראשונה משתמשת בשרשתית חיה ונייר סינון תאית כדי להפריד מקטעים חיצוניים מוט, ואילו השני משתמש ברשתית ליופילית וקלטת דבק כדי לקלף שכבות מגזר פנימיות וחיצוניות מוט.
Abstract
קולטני אור מוט הם נוירונים חושיים מקוטבים מאוד עם תאים נפרדים. מוטות העכבר ארוכים (~ 80 מיקרומטר) ודקים (~ 2 מיקרומטר) והם ארוזים לרוחב בשכבה החיצונית ביותר של הרשתית, שכבת קולטן האור, וכתוצאה מכך יישור של תאים תת-תאיים אנלוגיים. באופן מסורתי, חתך משיק של הרשתית השטוחה הקפואה שימש לחקר התנועה והלוקליזציה של חלבונים בתוך תאי מוט שונים. עם זאת, העקמומיות הגבוהה של רשתית העכבר הדומיננטית מוט עושה חתך משיק מאתגר. מונע על ידי המחקר של הובלת חלבון בין תאים, פיתחנו שתי שיטות פילינג לבודד באופן אמין את החלק החיצוני מוט (ROS) ותאים תת תאיים אחרים עבור כתמים מערביים. הטכניקות המהירות והפשוטות יחסית שלנו מספקות שברים מועשרים ותת-תאיים ספציפיים כדי למדוד כמותית את ההפצה וההפצה מחדש של חלבונים קולטני אור חשובים במוטות רגילים. יתר על כן, טכניקות בידוד אלה יכולות גם להיות מותאמות בקלות כדי לבודד ולחקור כמותית את הרכב החלבון של שכבות תאיות אחרות בתוך רשתית בריאה ומנוונת כאחד.
Introduction
תאי קולטני אור מוט, ארוזים היטב בשכבה החיצונית ביותר של הרשתית העצבית, הם חלק בלתי נפרד מראיית אור עמום. כדי לתפקד כמוני פוטון נאמנים, מוטות משתמשים במסלול איתות מבוסס חלבון G, המכונה פוטו-טרנסדוקציה, כדי ליצור תגובות מהירות, מוגברות וניתנות לשחזור ללכידת פוטון יחיד. תגובה זו לאור בסופו של דבר מפעילה שינוי בזרם בקרום הפלזמה ולאחר מכן מאותתת לשאר מערכת הראייה1. כפי ששמם מרמז, לכל תא מוט יש צורה ייחודית דמוית מוט והוא מציג מורפולוגיה תאית מקוטבת מאוד, המורכבת מקטע חיצוני (OS), קטע פנימי (IS), גוף התא (CB) ומסוף סינפטי (ST). לכל תא תת-תאי יש מכונות חלבון ספציפיות (קשורות ממברנה ומסיסות), תכונות ביו-מולקולריות ומתחמי חלבון הממלאים תפקידים מכריעים כגון פוטו-טרנסדוקציה חזותית, משק בית כללי וסינתזת חלבונים, והעברה סינפטית 2,3.
לפני יותר מ -30 שנה, התנועה ההדדית התלויה באור של חלבונים תת-תאיים, במיוחד טרנסדוצין (הרחק ממערכת ההפעלה) ו arrestin (לכיוון מערכת ההפעלה), נצפתה לראשונה4,5,5,6,7. בשלב מוקדם, תופעה נצפתה זו התקבלה בספקנות, בין היתר בשל הפגיעות של אימונוהיסטוכימיה למסכת אפיטופה8. בתחילת שנות ה -2000, טרנסלוקציה חלבון תלוי גירוי אושרה באמצעות טכניקת חתך פיזית קפדנית ומפרכת9. חתך משיק סדרתי של רשתית מכרסמים שטוחה קפואה ואחריו חיסונים גילה כי transducin9,10, arrestin11,12, ו recoverin13 כל לעבור הפצה מחדש תת תאית בתגובה לאור. הוא האמין כי טרנסלוקציה מונחית אור של חלבוני איתות מפתח אלה לא רק מווסת את הרגישות של מפל phototransduction9,14,15, אלא גם עשוי להיות neuroprotective מפני נזק אור16,17,18. מכיוון שהעברת חלבונים מונחית אור במוטות נראית משמעותית מאוד לביולוגיה ופיזיולוגיה של תאי מוט, טכניקות המאפשרות בידוד של תאים תת-תאיים שונים כדי לקבוע את התפלגות החלבון הן כלי מחקר יקרי ערך.
נכון לעכשיו, ישנן מספר שיטות שמטרתן לבודד את התאים התת-תאיים מוט. עם זאת, שיטות אלה יכולות להיות ארוכות וקשה להתרבות, או לדרוש כמות ניכרת של בידוד רשתית. תכשירי קטע חיצוני מוט (ROS) באמצעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות19, למשל, משמש בדרך כלל כדי להפריד את ROS מן הומוגנט רשתית. שיטה זו נמצאת בשימוש נרחב עבור כתם מערבי, אבל ההליך הוא זמן רב מאוד דורש מינימום של 8-12 retinae murine20. מצד שני, חתך משיק סדרתי של מורין קפוא ורשתית חולדה יושם בהצלחה בבידוד מערכת ההפעלה, IS, CB, ו ST9,11,13. עם זאת, שיטה זו מאתגרת מבחינה טכנית בשל הצורך של שיטוח מלא של רשתית מורין קטנה ומעוקלת מאוד כדי ליישר את שכבות הרשתית לפני חתך משיק. מכיוון שיש שפע של מודלים של עכברים ועכברים מהונדסים המסכמים מחלות של מערכת הראייה, יצירת טכניקה המפרידה באופן אמין, מהיר וקל מפריד בין תאי מוט בודדים מחזיקה בהבטחה בחשיפת התהליכים הפיזיולוגיים המתרחשים בכל תא מיוחד ואת המנגנונים העומדים בבסיס תהליכים חזותיים בבריאות ובמחלות.
כדי להקל על חקירות אלה, אנו מתארים שתי שיטות פילינג המבודדות תאים תת-תאיים מוט בקלות רבה יותר מהפרוטוקולים הנוכחיים. שיטת הפילינג הראשונה, המותאמת מטכניקה לחשיפת תאים דו-קוטביים בעלי תווית פלואורסצנטית להקלטת מהדק תיקון21, משתמשת בנייר סינון תאית כדי להסיר ברצף את ה- ROS מרשתית מורין חיה ומבודדת (איור 1). השיטה השנייה, המותאמת מהליך המבודד את שלוש שכבות תאי הרשתית העיקריות מרשתית אפרוח 22 וצפרדע23, משתמשת בסרט הדבקה כדי להסיר את החלק הפנימי ROS והמוט (RIS) מרשתית ליופילית (איור 2). ניתן להשלים את שני ההליכים תוך שעה אחת והם ידידותיים במידה ניכרת למשתמש. אנו מספקים אימות של האפקטיביות של שני פרוטוקולי הפרדה אלה עבור כתם מערבי על ידי שימוש ברשתית כהה מותאמת אור חשוף אור מעכברי C57BL / 6J כדי להדגים טרנסלוקציה הנגרמת על ידי אור של transducin מוט (GNAT1) ו arrestin (ARR1). יתר על כן, באמצעות שיטת פילינג הקלטת, אנו מספקים ראיות נוספות לכך שניתן להשתמש בטכניקה שלנו כדי לבחון ולטפל בחוסר עקביות בין נתוני לוקליזציה של חלבונים שנרכשו על ידי אימונוציטוכימיה (ICC) וכתמים מערביים. באופן ספציפי, הטכניקה שלנו הראתה כי: 1) חלבון קינאז C-אלפא (PKCα) איזופורם קיים לא רק בתאים דו קוטביים, אלא גם מורין ROS ו RIS, אם כי בריכוזים נמוכים24,25, ו 2) rhodopsin קינאז (GRK1) נמצא בעיקר במדגם מערכת ההפעלה המבודדת. נתונים אלה מדגימים את האפקטיביות של שתי טכניקות הפילינג שלנו להפרדה וכימות של חלבוני מוט ורשתית ספציפיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחלות רשתית רבות משפיעות על תאי קולטני המוט, מה שמוביל למוות מוט, ובסופו של דבר, אובדן ראייה מלא37. חלק ניכר מהמקורות הגנטיים והמכניסטיים של ניוון הרשתית האנושית שוחזרו בהצלחה במודלים רבים של עכברים לאורך השנים. בהקשר זה, היכולת להפריד בקלות ובאופן סלקטיבי תאים תת-תאיים של מוט ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH גרנט EY12155, EY027193, ו EY027387 ל- JC. אנו מודים לד”ר ספירידון מיכלקיס (קלטק, פסדינה, ארה”ב) ולנטלי צ’ן (USC, לוס אנג’לס, ארה”ב) על הגהת כתב היד. ברצוננו גם להודות לד”ר סת’ ראפינס (USC, לוס אנג’לס, ארה”ב) וד”ר יאנוס פטי-פיטרדי (USC, לוס אנג’לס, ארה”ב) על שסיפקו את הציוד הדרוש לאיסוף צילומי המחבר שסופקו. חומר מ: Kasey Rose ואח ‘, הפרדה של תאי קולטן פוטורצפטור ברשתית העכבר לניתוח חלבון, ניוון עצבי מולקולרי, פורסם [2017], [טבע ספרינגר].
Materials
| 100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter | N/A | N/A | |
| 100% O2 tank | N/A | N/A | |
| 1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 μm | Genesee Scientific | 25-235 | |
| 4X SDS Sample Buffer | Millipore Sigma | 70607-3 | |
| 50 mL Falcon tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 95% O2 and 5% CO2 tank | N/A | N/A | |
| Ames’ Medium with L-glutamine, without bicarbonate | Sigma-Aldrich | A1420 | |
| CaCl2 (99%, dihydrate) | Sigma | C-3881 | |
| Drierite (Anhydrous calcium sulfate, >98% CaSO4, >2% CoCl2) | WA Hammond Drierite Co LTD | 21005 | |
| Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm) | Falcon-Corning | 08-757-100A | |
| Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) | Falcon-Corning | 08-772F | |
| Feather Scalpel (No. 10, 40 mm) | VWR | 100499-578 | |
| Feather Scalpel (No. 11, 40 mm) | VWT | 100499-580 | |
| KCl (99%) | Sigma | P-4504 | |
| Kimble Kontes pellet pestle | Sigma | z359971 | |
| Labconco Fast-Freeze Flasks | Labconco | N/A | |
| LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask | N/A | N/A | |
| MgCl2 | Sigma | M-9272 | |
| Milli-Q/de-ionized water | EMD Millipore | N/A | |
| Na2HPO4 (powder) | J.T. Baker | 4062-01 | |
| NaCl (crystal) | EMD Millipore | Sx0420-3 | |
| NaHCO3 | Amresco | 0865 | |
| OmniPur EDTA | EMD | 4005 | |
| OmniPur HEPES, Free Acid | EMD | 5320 | |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Reynolds Wrap Aluminum Foil | Reynolds Brands | N/A | |
| Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m) | Scotch-3M | N/A | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D67501 | |
| Spectrafuge mini centrifuge | Labnet International, Inc | C1301 | |
| Tissue incubation chamber (purchased or custom made) | N/A | N/A | |
| Tris-HCl | J.T.Baker | 4103-02 | |
| Triton X-100 | Signma-Aldrich | T8787 | |
| VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine | SP Scientific | N/A | |
| VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm) | VWR | 28310-015 | |
| Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 μm) | Whatman/GE Healthcare | 1001-090 | |
| Wide bore transfer pipet, Global Scientific | VWR | 76285-362 |
References
- Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. G proteins and phototransduction. Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).
- Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
- Koch, K. W., Dell’Orco, D. Protein and signaling networks in vertebrate photoreceptor cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 67 (2015).
- Semple-Rowland, S. L., Dawson, W. W. Cyclic light intensity threshold for retinal damage in albino rats raised under 6 lx. Experimental Eye Research. 44 (5), 643-661 (1987).
- Brann, M. R., Cohen, L. V. Diurnal expression of transducin mRNA and translocation of transducin in rods of rat retina. Science. 235 (4788), 585-587 (1987).
- Philp, N. J., Chang, W., Long, K. Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina. FEBS Letters. 225 (1-2), 127-132 (1987).
- Broekhuyse, R. M., Tolhuizen, E. F., Janssen, A. P., Winkens, H. J. Light induced shift and binding of S-antigen in retinal rods. Current Eye Research. 4 (5), 613-618 (1985).
- Roof, D. J., Heth, C. A. Expression of transducin in retinal rod photoreceptor outer segments. Science. 241 (4867), 845-847 (1988).
- Sokolov, M., et al. Massive light-driven translocation of transducin between the two major compartments of rod cells: a novel mechanism of light adaptation. Neuron. 34 (1), 95-106 (2002).
- Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
- Strissel, K. J., Sokolov, M., Trieu, L. H., Arshavsky, V. Y. Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin. The Journal of Neuroscience. 26 (4), 1146-1153 (2006).
- Nair, K. S., et al. Light-dependent redistribution of arrestin in vertebrate rods is an energy-independent process governed by protein-protein interactions. Neuron. 46 (4), 555-567 (2005).
- Strissel, K. J., et al. Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors. The Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 29250-29255 (2005).
- Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends in Cell Biology. 16 (11), 560-568 (2006).
- Majumder, A., et al. Transducin translocation contributes to rod survival and enhances synaptic transmission from rods to rod bipolar cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12468-12473 (2013).
- Fain, G. L. Why photoreceptors die (and why they don’t). BioEssays. 28 (4), 344-354 (2006).
- Chen, J., Simon, M. I., Matthes, M. T., Yasumura, D., LaVail, M. M. Increased susceptibility to light damage in an arrestin knockout mouse model of Oguchi disease (stationary night blindness). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2978-2982 (1999).
- Song, X., et al. Arrestin-1 expression level in rods: balancing functional performance and photoreceptor health. Neuroscience. 174, 37-49 (2011).
- McConnell, D. G. The isolation of retinal outer segment fragments. The Journal of Cell Biology. 27 (3), 459-473 (1965).
- Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
- Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. Patch clamp recordings of retinal bipolar cells in response to extracellular electrical stimulation in wholemount mouse retina. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 3363-3366 (2015).
- Guido, M. E., et al. A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies. Brain Research. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).
- Hayashi, F., et al. Phosphorylation by cyclin-dependent protein kinase 5 of the regulatory subunit of retinal cGMP phosphodiesterase. II. Its role in the turnoff of phosphodiesterase in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 275 (42), 32958-32965 (2000).
- Wolbring, G., Cook, N. J. Rapid purification and characterization of protein kinase C from bovine retinal rod outer segments. European Journal of Biochemistry. 201 (3), 601-606 (1991).
- Williams, D. S., et al. Characterization of protein kinase C in photoreceptor outer segments. Journal of Neurochemistry. 69 (4), 1693-1702 (1997).
- Watson, A. J., Aragay, A. M., Slepak, V. Z., Simon, M. I. A novel form of the G protein beta subunit Gbeta5 is specifically expressed in the vertebrate retina. The Journal of Biological Chemistry. 271 (45), 28154-28160 (1996).
- Makino, E. R., Handy, J. W., Li, T., Arshavsky, V. Y. The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G protein beta subunit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1947-1952 (1999).
- Chen, J., Shi, G., Concepcion, F. A., Xie, G., Oprian, D. Stable rhodopsin/arrestin complex leads to retinal degeneration in a transgenic mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. The Journal of Neuroscience. 26 (46), 11929-11937 (2006).
- Chen, C. K., et al. Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3718-3722 (1999).
- Zhang, H., et al. Mistrafficking of prenylated proteins causes retinitis pigmentosa 2. FASEB Journal. 29 (3), 932-942 (2015).
- Weiss, E. R., et al. Species-specific differences in expression of G-protein-coupled receptor kinase (GRK) 7 and GRK1 in mammalian cone photoreceptor cells: implications for cone cell phototransduction. The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9175-9184 (2001).
- Zhao, X., Huang, J., Khani, S. C., Palczewski, K. Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1). The Journal of Biological Chemistry. 273 (9), 5124-5131 (1998).
- Newton, A. C., Williams, D. S. Involvement of protein kinase C in the phosphorylation of rhodopsin. The Journal of Biological Chemistry. 266 (27), 17725-17728 (1991).
- Pinzon-Guzman, C., Zhang, S. S., Barnstable, C. J. Specific protein kinase C isoforms are required for rod photoreceptor differentiation. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18606-18617 (2011).
- Sokal, I., et al. Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475. The Journal of Biological Chemistry. 278 (10), 8316-8325 (2003).
- Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis. Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).
- Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews. Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).
