यह प्रोटोकॉल प्रोटीन विश्लेषण के लिए मुरीन रॉड फोटोरिसेप्टर के उपकोशिकीय डिब्बों को अलग करने के लिए दो तकनीकों को प्रस्तुत करता है। पहली विधि रॉड बाहरी खंडों को अलग करने के लिए लाइव रेटिना और सेल्यूलोज फिल्टर पेपर का उपयोग करती है, जबकि दूसरी रॉड आंतरिक और बाहरी खंड परतों को छीलने के लिए लायोफिलाइज्ड रेटिना और चिपकने वाले टेप को नियोजित करती है।
रॉड फोटोरिसेप्टर अलग-अलग डिब्बों के साथ अत्यधिक ध्रुवीकृत संवेदी न्यूरॉन्स हैं। माउस छड़ें लंबी (~ 80 μm) और पतली (~ 2 μm) होती हैं और रेटिना की सबसे बाहरी परत, फोटोरिसेप्टर परत में पार्श्व रूप से पैक की जाती हैं, जिसके परिणामस्वरूप अनुरूप उपकोशिकीय डिब्बों का संरेखण होता है। परंपरागत रूप से, जमे हुए फ्लैट-माउंटेड रेटिना के स्पर्शरेखा सेक्शनिंग का उपयोग विभिन्न रॉड डिब्बों के भीतर प्रोटीन के आंदोलन और स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए किया गया है। हालांकि, रॉड-प्रमुख माउस रेटिना की उच्च वक्रता स्पर्शरेखा सेक्शनिंग को चुनौतीपूर्ण बनाती है। डिब्बों के बीच प्रोटीन परिवहन के अध्ययन से प्रेरित होकर, हमने दो छीलने के तरीके विकसित किए जो पश्चिमी धब्बों के लिए रॉड बाहरी खंड (आरओएस) और अन्य उपकोशिकीय डिब्बों को मज़बूती से अलग करते हैं। हमारी अपेक्षाकृत त्वरित और सरल तकनीकें सामान्य छड़ों में महत्वपूर्ण फोटोरिसेप्टर प्रोटीन के वितरण और पुनर्वितरण को मात्रात्मक रूप से मापने के लिए समृद्ध और उपकोशिकीय-विशिष्ट अंश प्रदान करती हैं। इसके अलावा, इन अलगाव तकनीकों को भी आसानी से अलग करने और मात्रात्मक रूप से स्वस्थ और विघटित रेटिना दोनों के भीतर अन्य सेलुलर परतों की प्रोटीन संरचना की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
रॉड फोटोरिसेप्टर कोशिकाएं, तंत्रिका रेटिना की सबसे बाहरी परत में कसकर पैक की जाती हैं, मंद प्रकाश दृष्टि का एक अभिन्न अंग हैं। वफादार फोटॉन काउंटर के रूप में कार्य करने के लिए, छड़ें एकल फोटॉन कैप्चर के लिए तेजी से, प्रवर्धित और पुन: प्रस्तुत करने योग्य प्रतिक्रियाओं को उत्पन्न करने के लिए एक जी-प्रोटीन-आधारित सिग्नलिंग मार्ग का उपयोग करती हैं, जिसे फोटोट्रांसडक्शन कहा जाता है। प्रकाश के लिए यह प्रतिक्रिया अंततः प्लाज्मा झिल्ली पर वर्तमान में परिवर्तन को ट्रिगर करती है और बाद में दृश्य प्रणाली के बाकी हिस्सों को संकेत दिया जाता है1। जैसा कि उनके नाम का तात्पर्य है, प्रत्येक रॉड सेल में एक अलग रॉड जैसी आकृति होती है और एक अत्यधिक ध्रुवीकृत सेलुलर आकृति विज्ञान प्रदर्शित करती है, जिसमें एक बाहरी खंड (ओएस), आंतरिक खंड (आईएस), सेल बॉडी (सीबी), और सिनैप्टिक टर्मिनल (एसटी) शामिल होते हैं। प्रत्येक उपकोशिकीय डिब्बे में विशिष्ट प्रोटीन मशीनरी (झिल्ली-बाध्य और घुलनशील), बायोमोलेक्यूलर विशेषताएं, और प्रोटीन कॉम्प्लेक्स होते हैं जो दृश्य फोटोट्रांसडक्शन, सामान्य हाउसकीपिंग और प्रोटीन संश्लेषण और सिनैप्टिक ट्रांसमिशन 2,3 जैसी महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।
30 साल पहले, उपकोशिकीय प्रोटीन के प्रकाश-निर्भर पारस्परिक आंदोलन, विशेष रूप से ट्रांसड्यूसिन (ओएस से दूर) और अरेस्टिन (ओएस की ओर), पहली बार 4,5,6,7 देखा गया था। शुरुआती दिनों में, इस मनाया घटना संदेह के साथ प्राप्त किया गया था, कुछ हद तक एपिटोप मास्किंग 8 के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री की भेद्यता के कारण। 2000 के दशक की शुरुआत में, एक कठोर और कठिन भौतिक सेक्शनिंग तकनीक का उपयोग करके उत्तेजना-निर्भर प्रोटीन ट्रांसलोकेशन की पुष्टि की गई थी। जमे हुए फ्लैट-माउंटेड कृंतक रेटिना के सीरियल स्पर्शरेखा सेक्शनिंग के बाद इम्यूनोब्लॉटिंग से पता चला कि ट्रांसड्यूसिन 9, 10, 11,12 में गिरफ्तार, और 13 में रिकवरी सभी प्रकाश के जवाब में उपकोशिकीय पुनर्वितरण से गुजरते हैं। यह माना जाता है कि इन प्रमुख सिग्नलिंग प्रोटीनों का प्रकाश-संचालित स्थानांतरण न केवल फोटोट्रांसडक्शन कैस्केड 9,14,15 की संवेदनशीलता को नियंत्रित करता है, बल्कि प्रकाश क्षति 16,17,18 के खिलाफ न्यूरोप्रोटेक्टिव भी हो सकता है। क्योंकि छड़ में प्रकाश-संचालित प्रोटीन परिवहन रॉड सेल जीव विज्ञान और शरीर विज्ञान के लिए बहुत महत्वपूर्ण प्रतीत होता है, इसलिए प्रोटीन वितरण निर्धारित करने के लिए विभिन्न उपकोशिकीय डिब्बों के अलगाव की अनुमति देने वाली तकनीकें मूल्यवान अनुसंधान उपकरण हैं।
वर्तमान में, रॉड उपकोशिकीय डिब्बों को अलग करने के उद्देश्य से कुछ तरीके हैं। हालांकि, इन तरीकों को पुन: उत्पन्न करने के लिए लंबा और कठिन हो सकता है, या रेटिना आइसोलेट की एक बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है। घनत्व ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूगेशन 19 के माध्यम से रॉड बाहरी खंड (आरओएस) तैयारी, उदाहरण के लिए, आमतौर पर आरओएस को रेटिना होमोजेनेट से अलग करने के लिए उपयोग किया जाता है। इस विधि का व्यापक रूप से पश्चिमी धब्बा के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन प्रक्रिया बहुत समय लेने वाली है और इसके लिए कम से कम 8-12 म्यूरीन रेटिना 20 की आवश्यकता होती है। दूसरी ओर, जमे हुए मुरीन और चूहे रेटिना के सीरियल स्पर्शरेखा सेक्शनिंग को ओएस, आईएस, सीबी और एसटी 9, 11,13 को अलग करने में सफलतापूर्वक लागू किया गया है। हालांकि, स्पर्शरेखा सेक्शनिंग से पहले रेटिना परतों को संरेखित करने के लिए छोटे और अत्यधिक घुमावदार मुरीन रेटिना को पूरी तरह से समतल करने की आवश्यकता के कारण यह विधि तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है। चूंकि माउस मॉडल और ट्रांसजेनिक चूहों की बहुतायत है, इसलिए दृश्य प्रणाली की बीमारियों को दोहराने वाली तकनीक का निर्माण जो मज़बूती से, जल्दी से, और आसानी से अलग हो जाता है व्यक्तिगत रॉड डिब्बों को प्रत्येक विशेष डिब्बे में होने वाली शारीरिक प्रक्रियाओं और तंत्र ों को प्रकट करने में वादा करता है जो स्वास्थ्य और बीमारी में दृश्य प्रक्रियाओं को रेखांकित करते हैं।
इन जांचों को सुविधाजनक बनाने के लिए, हम दो छीलने के तरीकों का वर्णन करते हैं जो वर्तमान प्रोटोकॉल की तुलना में रॉड उपकोशिकीय डिब्बों को अधिक आसानी से अलग करते हैं। पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग 21 के लिए फ्लोरोसेंटली लेबल द्विध्रुवी कोशिकाओं को उजागर करने के लिए एक तकनीक से अनुकूलित पहली छीलने की विधि, एक जीवित, अलग-थलग मुरीन रेटिना (चित्रा 1) से आरओएस को क्रमिक रूप से हटाने के लिए सेल्यूलोज फिल्टर पेपर को नियोजित करती है। दूसरी विधि, एक प्रक्रिया से अनुकूलित है जो एक चिक 22 और फ्रॉग 23 रेटिना से तीन प्राथमिक रेटिना सेल परतों को अलग करती है, एक लायोफिलाइज्ड रेटिना (चित्रा 2) से आरओएस और रॉड आंतरिक खंड (आरआईएस) को हटाने के लिए चिपकने वाले टेप का उपयोग करती है। दोनों प्रक्रियाओं को 1 घंटे में पूरा किया जा सकता है और काफी उपयोगकर्ता के अनुकूल हैं। हम रॉड ट्रांसड्यूसिन (GNAT1) और अरेस्टिन (ARR1) के प्रकाश-प्रेरित स्थानांतरण को प्रदर्शित करने के लिए C57BL / 6J चूहों से अंधेरे-अनुकूलित और प्रकाश-उजागर रेटिना का उपयोग करके पश्चिमी धब्बा के लिए इन दो पृथक्करण प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता का सत्यापन प्रदान करते हैं। इसके अलावा, टेप छीलने की विधि का उपयोग करते हुए, हम अतिरिक्त सबूत प्रदान करते हैं कि हमारी तकनीक का उपयोग इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री (आईसीसी) और पश्चिमी धब्बों द्वारा अधिग्रहित प्रोटीन स्थानीयकरण डेटा के बीच विसंगतियों की जांच और समाधान करने के लिए किया जा सकता है। विशेष रूप से, हमारी तकनीक से पता चला है कि: 1) प्रोटीन किनेज सी-अल्फा (पीकेसीα) आइसोफॉर्म न केवल द्विध्रुवी कोशिकाओं में मौजूद है, बल्कि मुरीन आरओएस और आरआईएस में भी मौजूद है, हालांकि कम सांद्रता में 24,25, और 2) रोडोप्सिन किनेज (जीआरके 1) मुख्य रूप से पृथक ओएस नमूने में मौजूद है। ये डेटा विशिष्ट रॉड और रेटिना प्रोटीन को अलग करने और परिमाणित करने के लिए हमारी दो छीलने की तकनीकों की प्रभावशीलता का प्रदर्शन करते हैं।
कई रेटिना रोग रॉड फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं को प्रभावित करते हैं, जिससे रॉड की मृत्यु हो जाती है और अंततः, पूर्ण दृष्टि हानि होती है37। मानव रेटिना अध: पतन के आनुवंशिक और यांत्रिक मूल का एक महत्वपूर…
The authors have nothing to disclose.
इस काम को NIH अनुदान EY12155, EY027193, और EY027387 द्वारा जेसी के लिए समर्थित किया गया था। हम डॉ Spyridon Michalakis (Caltech, Pasadena, संयुक्त राज्य अमेरिका) और नताली चेन (यूएससी, लॉस एंजिल्स, संयुक्त राज्य अमेरिका) पांडुलिपि proofreading के लिए आभारी हैं. हम डॉ सेठ रफिंस (यूएससी, लॉस एंजिल्स, यूएसए) और डॉ जानोस पेटी-पीटरडी (यूएससी, लॉस एंजिल्स, यूएसए) को लेखक द्वारा प्रदान किए गए फुटेज को इकट्ठा करने के लिए आवश्यक उपकरण प्रदान करने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। से सामग्री: Kasey Rose et al, प्रोटीन विश्लेषण के लिए माउस रेटिना में फोटोरिसेप्टर सेल डिब्बों का पृथक्करण, आणविक Neurodegeneration, प्रकाशित [2017], [Springer प्रकृति].।
100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter | N/A | N/A | |
100% O2 tank | N/A | N/A | |
1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 μm | Genesee Scientific | 25-235 | |
4X SDS Sample Buffer | Millipore Sigma | 70607-3 | |
50 mL Falcon tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
95% O2 and 5% CO2 tank | N/A | N/A | |
Ames’ Medium with L-glutamine, without bicarbonate | Sigma-Aldrich | A1420 | |
CaCl2 (99%, dihydrate) | Sigma | C-3881 | |
Drierite (Anhydrous calcium sulfate, >98% CaSO4, >2% CoCl2) | WA Hammond Drierite Co LTD | 21005 | |
Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm) | Falcon-Corning | 08-757-100A | |
Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) | Falcon-Corning | 08-772F | |
Feather Scalpel (No. 10, 40 mm) | VWR | 100499-578 | |
Feather Scalpel (No. 11, 40 mm) | VWT | 100499-580 | |
KCl (99%) | Sigma | P-4504 | |
Kimble Kontes pellet pestle | Sigma | z359971 | |
Labconco Fast-Freeze Flasks | Labconco | N/A | |
LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask | N/A | N/A | |
MgCl2 | Sigma | M-9272 | |
Milli-Q/de-ionized water | EMD Millipore | N/A | |
Na2HPO4 (powder) | J.T. Baker | 4062-01 | |
NaCl (crystal) | EMD Millipore | Sx0420-3 | |
NaHCO3 | Amresco | 0865 | |
OmniPur EDTA | EMD | 4005 | |
OmniPur HEPES, Free Acid | EMD | 5320 | |
Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
Reynolds Wrap Aluminum Foil | Reynolds Brands | N/A | |
Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m) | Scotch-3M | N/A | |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D67501 | |
Spectrafuge mini centrifuge | Labnet International, Inc | C1301 | |
Tissue incubation chamber (purchased or custom made) | N/A | N/A | |
Tris-HCl | J.T.Baker | 4103-02 | |
Triton X-100 | Signma-Aldrich | T8787 | |
VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine | SP Scientific | N/A | |
VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm) | VWR | 28310-015 | |
Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 μm) | Whatman/GE Healthcare | 1001-090 | |
Wide bore transfer pipet, Global Scientific | VWR | 76285-362 |