Summary
هنا ، نصف بروتوكولا محسنا لانسداد الوريد الشبكي باستخدام وردة البنغال ونظام مجهر تصوير الشبكية الموجه بالليزر مع توصيات لزيادة قابليته للتكاثر في السلالات المعدلة وراثيا.
Abstract
غالبا ما تستخدم نماذج الفئران لانسداد الوريد الشبكي (RVO) في طب العيون لدراسة إصابة نقص تروية نقص الأكسجين في الشبكية العصبية. في هذا التقرير ، يتم توفير طريقة مفصلة تشير إلى الخطوات الحاسمة مع توصيات للتحسين لتحقيق معدلات انسداد ناجحة باستمرار عبر سلالات الفئران المعدلة وراثيا المختلفة. يتكون نموذج الماوس RVO بشكل أساسي من إعطاء صبغة محسسة للضوء عن طريق الوريد متبوعة بالتخثير الضوئي بالليزر باستخدام مجهر تصوير شبكية متصل بليزر موجه للعيون. تم تحديد ثلاثة متغيرات كمحددات لاتساق الانسداد. من خلال ضبط وقت الانتظار بعد إدارة البنغال الوردية وتحقيق التوازن بين خط الأساس وإخراج الليزر التجريبي ، يمكن أن يكون التباين عبر التجارب محدودا وتحقيق معدل نجاح أعلى للانسداد. يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة أمراض الشبكية التي تتميز بوذمة الشبكية وإصابة نقص تروية نقص الأكسجين. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن هذا النموذج يؤدي إلى إصابة الأوعية الدموية ، فيمكن تطبيقه أيضا لدراسة الأوعية الدموية العصبية وموت الخلايا العصبية والالتهابات.
Introduction
انسداد الوريد الشبكي (RVO) هو مرض شائع في الأوعية الدموية في شبكية العين أثر على ما يقرب من 28 مليون شخص في جميع أنحاء العالم في عام 20151. يؤدي RVO إلى تدهور الرؤية وفقدانها لدى البالغين وكبار السن في سن العمل ، مما يمثل مرضا مستمرا يهدد البصر ويقدر أنه سيزداد خلال العقد القريب. بعض الأمراض المميزة ل RVO تشمل إصابة نقص تروية نقص الأكسجين ، وذمة الشبكية ، والالتهاب ، وفقدان الخلايا العصبية2. حاليا ، الخط الأول من العلاج لهذا الاضطراب هو من خلال إعطاء مثبطات عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF). بينما ساعد العلاج المضاد ل VEGF في تحسين وذمة الشبكية ، لا يزال العديد من المرضى يواجهون انخفاض الرؤية3. لمزيد من فهم الفيزيولوجيا المرضية لهذا المرض واختبار خطوط العلاج الجديدة المحتملة ، هناك حاجة لتشكيل بروتوكول نموذج فأر RVO وظيفي ومفصل لسلالات الفئران المختلفة.
تم تطوير نماذج الماوس باستخدام نفس جهاز الليزر المستخدم في المرضى من البشر ، مقترنا بنظام تصوير تم تحجيمه إلى الحجم الصحيح للماوس. تم الإبلاغ عن نموذج الماوس هذا من RVO لأول مرة في 2007 4 وتم تأسيسه بواسطة Ebneter وآخرين 4,5. في النهاية ، تم تحسين النموذج بواسطة Fuma et al. لتكرار المظاهر السريرية الرئيسية ل RVO مثل وذمة الشبكية6. منذ أن تم الإبلاغ عن النموذج لأول مرة ، استخدمته العديد من الدراسات باستخدام إدارة صبغة محسسة للضوء متبوعة بالتخثير الضوئي لأوردة الشبكية الرئيسية بالليزر. ومع ذلك ، فإن كمية ونوع الصبغة التي يتم إعطاؤها ، وقوة الليزر ، ووقت التعرض تختلف اختلافا كبيرا عبر الدراسات التي استخدمت هذه الطريقة. يمكن أن تؤدي هذه الاختلافات في كثير من الأحيان إلى زيادة التباين في النموذج ، مما يجعل من الصعب تكراره. حتى الآن ، لا توجد دراسات منشورة تحتوي على تفاصيل محددة حول السبل المحتملة لتحسينها.
يقدم هذا التقرير منهجية مفصلة لنموذج فأر RVO في سلالة C57BL / 6J وسلالة كاسباز 9 البطانية القابلة للحث على عقار تاموكسيفين (iEC Casp9KO) مع خلفية C57BL / 6J وذات صلة بأمراض RVO كسلالة مرجعية للفأر المعدل وراثيا. أظهرت دراسة سابقة أن التنشيط غير المبرمج للكابتيز البطاني caspase-9 يحرض على وذمة الشبكية ويعزز موت الخلايا العصبية8. ساعدت تجربة استخدام هذه السلالة في تحديد وتقديم نظرة ثاقبة نحو التعديلات المحتملة لتكييف نموذج فأر RVO ، والذي يمكن تطبيقه على سلالات أخرى معدلة وراثيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتبع هذا البروتوكول بيان جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون (ARVO) لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية. تمت الموافقة على تجارب القوارض ومراقبتها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) بجامعة كولومبيا.
ملاحظة: استخدمت جميع التجارب ذكور فئران عمرها شهرين تزن حوالي 20 جم.
1. إعداد وإدارة عقار تاموكسيفين للاستئصال الجيني المستحث للجينات floxed
ملاحظة: يمكن أن يتأثر قطر وعاء الشبكية بوزن الحيوان. تأكد من أن جميع الحيوانات المستخدمة في التجربة ذات أوزان متشابهة.
- تمييع تاموكسيفين في زيت الذرة إلى تركيز 20 ملغ / مل.
ملاحظة: تاموكسيفين مادة سامة وحساسة للضوء. يحفظ بعيدا عن الضوء ، على سبيل المثال ، باستخدام ورق الألمنيوم. - دوامة الحل لبضع ثوان.
- اتركيه في الفرن على حرارة 55 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: تأكد من أن عقار تاموكسيفين قد ذاب تماما. قد تكون دوامة إضافية ضرورية. - تخزين الحل في 4 °C لمدة تصل إلى 1 أسبوع.
- استخدم حقنة سعة 1 مل مزودة بإبرة 26 جم لحقن عقار تاموكسيفين. نظف منطقة الحقن بنسبة 70٪ إيثانول. يتم تطبيق 2 ملغ من عقار تاموكسيفين (100 ميكرولتر من 20 ملغ/مل) داخل الصفاق (IP) مرة واحدة يوميا للفترة المحددة وفقا لخط كري المحرض المحدد.
- اترك يومين من الراحة للحيوانات قبل بدء التجارب.
2. تحضير الكواشف للتخثير الضوئي بالليزر
- روز البنغال
ملاحظة: روز البنغال حساس للضوء. يخزن في الظلام حتى الاستخدام ويحضر طازجا للحصول على أفضل النتائج.- تحضير الورد البنغال عن طريق تخفيفه إلى 5 ملغ / مل في محلول ملحي معقم وترشيحه من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر.
- تحضير حقنة 1 مل مزودة بإبرة 26 غرام مع البنغال الوردي.
- الكيتامين / الزيلازين
- يتم تخفيف الكيتامين والزيلازين في محلول ملحي معقم وفقا للتركيزات التالية: الكيتامين (80-100 ملغ/كغ) وزيلازين (5-10 ملغ/كغ).
- كاربروفين
- تمييع كاربروفين إلى 1 ملغ / مل في محلول ملحي معقمة.
- تحضير حقنة 1 مل مزودة بإبرة 26 غرام مع كاربروفين.
- محلول ملحي معقم
- تحضير حقنة سعة 5 مل مزودة بإبرة 26 جم مع محلول ملحي معقم.
3. إعداد الليزر
- تعامل برفق مع كابل الألياف الضوئية وقم بتوصيله بصندوق التحكم بالليزر ومحول الليزر لمجهر تصوير الشبكية.
- قم بتشغيل صندوق مصباح مجهر تصوير الشبكية.
- قم بتشغيل الكمبيوتر وافتح برنامج التصوير.
- ضبط توازن اللون الأبيض باستخدام قطعة من الورق الأبيض ووضعها أمام قطعة عين الفأرة والنقر على ضبط في برنامج التصوير.
- قم بتشغيل صندوق التحكم بالليزر عن طريق تدوير المفتاح واتباع الإرشادات التي تظهر على شاشة صندوق التحكم بالليزر.
ملاحظة: الليزر المستخدم في هذه التجربة هو من الفئة 3B ويمكن أن يسبب تلف العين. ارتد نظارات واقية عند تشغيل الليزر. - تحقق من طاقة الليزر الأساسية.
- استخدم مقياس طاقة الليزر.
- اضبط شاشة صندوق التحكم بالليزر على المعلمات التالية: 50 ميجاوات و 2000 مللي ثانية.
- قم بتشغيل الليزر وضع عداد الطاقة أمام العدسة.
ملاحظة: تأكد من إطفاء ضوء المجهر أثناء اختبار طاقة الليزر الأساسية. - اضغط على دواسة مفتاح القدم لتنشيط الليزر.
- استهدف أن تكون قراءة طاقة الليزر 13-15 ميجاوات.
ملاحظة: ستحدد قراءات طاقة الليزر معدل نجاح انسداد الوريد الشبكي. إذا كانت قراءة طاقة الليزر منخفضة جدا ، فيمكن إجراء تعديلات على طاقة ووقت التعرض لليزر. انظر الجدول 1 للاطلاع على التوصيات.
- اضبط طاقة الليزر التجريبية عن طريق إعداد شاشة صندوق التحكم بالليزر للمعلمات التالية: 100 ميجاوات ، 1000 مللي ثانية.
- أطفئ الليزر.
ملاحظة: من أجل السلامة ومنع ارتفاع درجة الحرارة ، من الأفضل إبقاء الليزر بعيدا بين الفئران.
4. حقن الوريد ذيل الفأر من وردة البنغال
- صب 300 مل من الماء في دورق سعة 500 مل.
- سخني الدورق في فرن الميكروويف لمدة 1 دقيقة.
- ضع الشاش في الماء الدافئ في الدورق.
- ضع الماوس في مقيد.
- اضغط على الشاش في ذيل الفأر برفق وابحث عن الأوردة المتوسعة. تطهير موقع الحقن باستخدام مسح الكحول بعد تمدد الماء الدافئ.
- أدخل الإبرة في موقع الحقن واسحب المحقنة للتأكد من أنك في الوريد. بعد ذلك ، قم بحقن وريد ذيل الفأر ، مع إعطاء الكمية الصحيحة وفقا لوزن الحيوان (37.5 مجم / كجم). اضغط على موقع الحقن لتجنب ورم دموي أو نزيف. امسح الموقع.
- حرر الماوس من المقيد وأعده إلى القفص.
- اترك 8 دقائق حتى تنتشر وردة البنغال قبل حقن التخدير.
ملاحظة: سيوفر هذا ما مجموعه 10 دقائق بين حقن البنغال الوردي وتشعيع الليزر.
5. انسداد الأوردة الرئيسية
- قم بتشغيل منصة الماوس الساخنة.
- أضف قطرة واحدة من فينيليفرين وتروبيكاميد في كل عين.
- حقن 150 ميكرولتر من مادة التخدير والكيتامين (80-100 ملغم / كغم) والزيلازين (5-10 ملغم / كغم) IP.
ملاحظة: خلال هذا الإجراء ، تم إعطاء الماوس حقنتين IP. ومن ثم ، تم تناوب الجانبين. تم إعطاء حقن IP للتخدير في الربع السفلي الأيمن من البطن ، وتم حقن المحلول الملحي في الربع السفلي الأيسر من البطن. يوصى بسحب المحقنة قبل الحقن للتأكد من أن الإبرة في البطن وليس في أي أعضاء. - قرصة اصبع القدم الحيوان لتحديد عمق التخدير والانتظار حتى لا يستجيب.
- أضف قطرة واحدة من بروباراكائين هيدروكلوريد لكل عين (مسكن).
- أضف مرهم جل لكلتا العينين.
- حقن 150 ميكرولتر من كاربروفين تحت الجلد بين الأذنين.
- استيعاب الماوس على المنصة.
- اضبط المنصة حتى تصبح رؤية قاع الشبكية واضحة ومركزة.
- عد الأوردة الشبكية والتقط صورة لقاع العين.
ملاحظة: الأوردة الشبكية أغمق وأوسع من الشرايين. الأوردة والشرايين البديلة. ومع ذلك ، في بعض الأحيان يمكن أن يكون هناك شريان متفرع بالقرب من العصب البصري ، وبالتالي ، شريانين متجاورين. - قم بتشغيل الليزر واستهدف الوريد الشبكي على بعد حوالي 375 ميكرومتر من القرص البصري.
- قم بتشعيع الوعاء عن طريق الضغط على مفتاح القدم وتحريك شعاع الليزر قليلا حتى 100 ميكرومتر. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات وحرك شعاع الليزر بعد كل نبضة حتى لا يتركز التشعيع في مكان واحد.
- كرر التشعيع على السفن الرئيسية الأخرى لتحقيق 2-3 انسداد.
6. تحديد عدد الأوردة المسدودة في اليوم 0
- أطفئ المصباح بعد تشعيع الأوعية وانتظر لمدة 10 دقائق.
ملاحظة: التعرض للضوء يمكن أن يسبب تلف الشبكية والالتهابات. أطفئ المصباح أثناء وقت الانتظار لتقليل التعرض7. - أعد تشغيل المصباح واحسب عدد الأوردة المسدودة.
- التقط صورة لقاع العين.
7. الرعاية اللاحقة
- حقن 1 مل من محلول ملحي معقم IP.
ملاحظة: انظر تفاصيل حقن IP في القسم 5، الخطوة 3. - أضف قطرات العين المزلقة إلى كلتا العينين.
- أضف مرهم جل لكلتا العينين.
- راقب الفأر وهو يتعافى من التخدير ، ولا تعيده إلى القفص مع الحيوانات الأخرى حتى يتعافى تماما. يمكن إعطاء كاربروفين (5 ملغ / كغ) يوميا لمدة تصل إلى 2 أيام بعد العملية. إذا تم تطبيقه على البشر ، فإن الألم ليس من أعراض RVO.
ملاحظة: لا تترك الحيوانات دون مراقبة حتى تتعافى تماما من التخدير.
8. تقييم وذمة الشبكية عن طريق التصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT)
ملاحظة: يمكن القيام بهذه الخطوة في الوقت الذي يهمه المحقق. ذروة وذمة الشبكية للماوس C57BL / 6J هي 1 يوم بعد إجراء RVO. قد تختلف هذه النقطة الزمنية وفقا لخلفية الماوس.
- قم بتشغيل صندوق ضوء مجهر تصوير الشبكية وجهاز OCT ومنصة الماوس الساخنة.
- في اليوم التالي للانسداد ، اتبع الخطوات من 5.2 إلى 5.7 لتحضير الحيوان.
- افتح برامج التصوير و OCT.
- في برنامج OCT ، اضبط التنبيه على 5.
- خذ OCT على بعد 75 ميكرومتر من الحرق أو 4 نقرات.
- التقط صور OCT في أربعة أرباع من شبكية العين.
- تحليل صور OCT باستخدام برنامج التتبع.
- قارن سمك الشبكية للتدابير قبل التشعيع إلى 1 يوم بعد RVO أو في نقطة الاهتمام الزمنية.
ملاحظة: عند تحليل البيانات ، ضع في اعتبارك عدد الأوردة المشععة لأن هذا يمكن أن يؤثر على تطور وذمة الشبكية. ثم يتم القتل الرحيم للحيوانات عن طريق إعطاء مخدر تليها جراحة التروية غير البقاء على قيد الحياة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يهدف نموذج الماوس RVO إلى تحقيق انسداد في الأوردة الشبكية بنجاح ، مما يؤدي إلى إصابة نقص التأكسج ، وانهيار حاجز الشبكية الدموي ، وموت الخلايا العصبية ، وذمة الشبكية8. يوضح الشكل 1 جدولا زمنيا للخطوات لضمان قابلية التكرار ، وتخطيطيا للتصميم التجريبي ، ويحدد الخطوات التي يمكن تحسينها بشكل أكبر اعتمادا على الأسئلة التجريبية. الخطوات الثلاث الرئيسية التي يمكن تعديلها هي وقت الانتظار بعد إدارة البنغال الوردية ، وطاقة الليزر الأساسية ، وإخراج الليزر التجريبي. في هذا التقرير ، تم استخدام الفئران C57BL / 6J ، بالإضافة إلى زملاء القمامة WT و KO من خط فأر الضربة القاضية للخلية البطانية المحرضة caspase-9 (iEC Casp9) ، لتحديد الإعدادات المثلى عبر سلالات مختلفة.
يمكن أن يؤدي وقت الانتظار من حقن البنغال الوردي إلى تشعيع الليزر إلى تغيير نجاح التخثير الضوئي في الأوردة. قد يؤدي وقت الانتظار القصير جدا إلى انخفاض تركيز البنغال الوردي داخل الأوردة ، في حين أن وقت الانتظار الطويل جدا يمكن أن يؤدي إلى إزالة البنغال الوردي من الدورة الدموية في شبكية العين. يمكن أن تؤدي كلتا الحالتين إلى ضعف التخثير الضوئي وانسداد غير ناجح. عند اختبار عدد الانسدادات التي تم الحصول عليها مباشرة بعد التشعيع بالليزر ، كشفت مقارنة الحيوانات التي تم فحصها بالليزر بعد 10 و 20 دقيقة من إعطاء البنغال الوردي أنه لا توجد فروق في عدد الانسدادات التي تم تحقيقها (الشكل 2 ب). ومع ذلك ، فإن عدد الانسدادات المستمرة حتى 1 يوم بعد RVO انخفض بشكل ملحوظ في الحيوانات التي تم الليزر بعد 20 دقيقة من إعطاء البنغال الوردي بشكل مستقل عن النمط الوراثي. تشير هذه النتيجة إلى أنه عند دراسة الإصابة الحادة التي يسببها RVO ، فإن وقت الانتظار بعد إدارة البنغال الوردية يمكن أن يؤثر على استقرار الانسداد. يمكن أن يؤثر إعادة التروية المبكرة للأوردة (قبل 24 ساعة بعد الإصابة) على تطور وذمة الشبكية ، وبالتالي ، يجب التحكم فيها عن طريق تحديد وقت الانتظار الصحيح من إدارة وردة البنغال إلى تشعيع الليزر.
من حيث المبدأ ، فإن التخثير الضوئي الناجح الذي يؤدي إلى الانسداد مدفوع بقوة الليزر. على الرغم من أن هذا جزء مهم من العملية ، إلا أنه أيضا أحد أكبر مصادر التباين في النموذج ويجب تحسينه من أجل الاتساق. لتحقيق ذلك ، يوصى بقياس إخراج الليزر أثناء الإعداد قبل حقن الفئران بالبنغال الوردي. يتراوح الناتج الموصى به لطاقة الليزر الأساسية بين 13.0 و 15.0 ميجاوات. أدت طاقة الليزر الأساسية المنخفضة ، مثل 11.5 ميجاوات ، دون تعديل الطاقة التجريبية (100 ميجاوات) ، إلى عدم وجود انسداد ، كما هو موضح في الشكل 3. في المقابل ، أدى خرج الليزر الأساسي البالغ 13.5 ميجاوات بقوة تجريبية تبلغ 100 ميجاوات إلى انسداد ناجح. في الحالات التي كان فيها خرج الليزر أقل من 13.0 ميجاوات ، تمت زيادة الطاقة التجريبية إلى 110 ميجاوات لتحقيق نفس الانسدادات الناجحة كما هو الحال مع إخراج ليزر أساسي أعلى. عادة ، 100 ميغاواط هي الطاقة التجريبية القياسية. ومع ذلك ، إذا كان خرج الليزر أقل من 13.0 ميجاوات ، فيمكن تعويضه عن طريق تعديل الطاقة التجريبية بالنطاقات الموصى بها في الجدول 1.
وقد لوحظ حدوث أربعة أنواع رئيسية من الانسدادات بعد التخثير الضوئي بالليزر للأوردة . تم تلخيص هذه الأنواع من الانسدادات في الشكل 4 أ وتم تصنيفها وفقا لكمية تدفق الدم. الأوعية المسدودة بالكامل (لا يوجد تدفق للدم) ، والأوعية المغلقة جزئيا (المسدودة في الغالب بالتدفق العرضي) ، والمعاد تدويرها جزئيا (تدفق الدم الثابت دون انقطاع مع عائق) ، والأوعية المعاد تدويرها بالكامل (لا يوجد انسداد واضح على الإطلاق). للتحقق مما إذا كانت أنواع الانسدادات تتغير وفقا للنمط الجيني وتحديد الوقت المستغرق لكل حالة انسداد ، تم تقييم مقاطع فيديو مدتها 10 دقائق بعد تشعيع الليزر. ساعد هذا التقييم في تحديد أن الأوعية الدموية المشععة لفئران iEC Casp9 تقضي وقتا أطول في الحالات المعاد إحكابها جزئيا والمغلقة جزئيا مقارنة ب C57BL6 / J ، والتي تقضي وقتا أطول في الحالات المغلقة بالكامل (الشكل 4 ب).
يوضح الشكل 5 كيف تتغير حالة انسداد الأوعية بسرعة خلال أول 10 دقائق بعد التخثير الضوئي بالليزر. بمجرد مرور هذه ال 10 دقائق الأولية ، تستقر الانسدادات ويتم الحفاظ عليها حتى نقطة زمنية مدتها 24 ساعة. وبالتالي ، لتقييم العدد الأولي الدقيق للإطباق لكل عين ، يوصى بالانتظار لمدة 10 دقائق بعد التشعيع. حدد تقييم سابق لهذا النموذج أن معظم الانسدادات تتكرر بعد 8 أيام من التشعيع8 ؛ ومع ذلك ، يمكن أن يختلف معدل الانسدادات التي تتكرر يوميا حسب السلالة ويجب تحديدها في كل نموذج تجريبي. النموذج المقدم هنا هو إصابة حادة ويهدف إلى استخدامه لفهم المسارات التي تؤدي إلى الوذمة ، والتي تتطور في غضون 24 ساعة بعد الانسداد. سمة أخرى من RVO هي نزيف على شكل لهب ، والتي يمكن ملاحظتها في 24 ساعة بعد الإصابة ، كما هو موضح في الشكل 5.
قد تكشف المتابعة في 24 ساعة بعد RVO عن أمراض العيون الأخرى التي يمكن أن تحدث نتيجة لطريقة RVO. يشمل بعضها على سبيل المثال لا الحصر النزف تحت الشبكية (الذي يتميز برقعة دم مستمرة) ، وانفصال الشبكية ، والشبكية الإقفارية بالكامل (لا يوجد تدفق للدم في الأوردة والشرايين) ، وإعتام عدسة العين. يوضح الشكل 6 صور قاع العين مع OCT المقابل كأمثلة على ذلك باستثناء العيون التي يتشكل فيها إعتام عدسة العين (الشكل 6F) ، حيث لا يمكن إجراء OCT في وجود إعتام عدسة العين. يوضح الشكل 6 أ أمثلة لما تبدو عليه صورة قاع العين و OCT للعين غير المصابة كمرجع.
علم الأمراض المورفولوجي الرئيسي ل RVO في هذا النموذج هو وذمة الشبكية. لتقييم مستوى وذمة الشبكية ، يوصى بالتقاط صور OCT قبل يوم إجراء RVO لقراءة خط الأساس وفي نقطة الاهتمام. يوضح الشكل 7 القياس الكمي لوذمة الشبكية في العيون المصابة. مقياس آخر يستخدم لتحديد حالة الطبقات العصبية هو تقييم عدم تنظيم الطبقات الداخلية للشبكية (DRIL). هذا مقياس يستخدم في الإعداد السريري الذي يمثل عدم التروية الشعرية ، وهي سمة مميزة أخرى ل RVO5،9،10. يمكن العثور على مثال لهذا التقييم في الشكل 7 ب. يوضح الشكل 7C مثالا لصورة OCT مع التسميات المقابلة لكل طبقة شبكية.
الشكل 1: الجدول الزمني والتخطيطي لنموذج الماوس RVO. (أ) الجدول الزمني للأحداث من إدارة البنغال الوردية إلى تصوير الأوردة المسدودة. (ب) تمثيل موجز لطريقة تحقيق التخثير الضوئي الناجح للوريد الشبكي. تمثل المربعات الحمراء خطوات مهمة في العملية متغيرة للغاية ويمكن تحسينها لكل طراز ماوس ومسألة ذات أهمية. (ج) الأوردة الرئيسية في الشبكية (V) أوسع وأكثر قتامة مقارنة بالشرايين (A). سيتم تشعيع كل وريد رئيسي بليزر موجه يبلغ 532 نانومتر ، وحجم البقعة 50 ميكرومتر ، والطاقة 100 ميجاوات ، والمدة 1 ثانية ، والطاقة الإجمالية 0.3 جول ، والتعرض الإشعاعي 15278.87 جول / سم2 ، بمتوسط مسافة 375 ميكرومتر من العصب البصري. (د) يتسبب تطبيق الليزر في ظهور فقاعة تبخير مرئية على تصوير قاع العين تبلغ حوالي 150 ميكرومتر وتغطي <4٪ من إجمالي منطقة الشبكية. تمثل الأرقام الموقع واتجاه الحركة (الأسهم) المقترحة لشعاع الليزر عند تشعيع الأوعية. الاختصارات: A = الشريان. V = الوريد ؛ ON = العصب البصري. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: يعد وقت الانسداد الضوئي بالنسبة لإدارة البنغال الوردية أمرا بالغ الأهمية لنجاح التخثير الضوئي . (أ) صور قاع العين الشبكية ل iEC Casp9 WT و iEC Casp9 KO محجوبة بالصور بعد 10 و 20 دقيقة من إعطاء البنغال الوردي. تمثل الدوائر البيضاء الأوردة التي كان لها انسداد ناجح. (ب) عدد الانسدادات مباشرة بعد التشعيع (0 ساعة) ويوم واحد بعد التشعيع لمدة 10 دقائق و 20 دقيقة بعد حقن البنغال الوردي للأنماط الجينية المركبة. اختبار Welch t ، تشير أشرطة الخطأ إلى SEM. (ج) عدد الانسدادات مفصولة بالنمط الجيني. اختبار ANOVA ثنائي الاتجاه واختبار LSD لفيشر ؛ تشير أشرطة الخطأ إلى SEM. الاختصارات: WT = النوع البري ؛ KO = خروج المغلوب. SEM = الخطأ القياسي للمتوسط ؛ ANOVA = تحليل التباين ؛ LSD = الفرق الأقل أهمية ؛ ns = غير مهم ؛ P-RVO = انسداد الوريد بعد الشبكية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: يعد قياس خط الأساس وإخراج الليزر التجريبي من الخطوات الحاسمة لنجاح التخثير الضوئي. صور قاع العين الشبكية ل iEC Casp9 WT و iEC Casp9 KO بعد 10 دقائق من التخثير الضوئي ؛ محجوبة بالصور بمستويات مختلفة من خط الأساس وإخراج الليزر التجريبي. يمكن تعويض خرج الليزر الأساسي المنخفض بإخراج ليزر تجريبي (12.8 ميجاوات ، 110 ميجاوات). تمثل الدوائر البيضاء الأوردة التي كان لها انسداد ناجح. الاختصارات: WT = النوع البري ؛ KO = خروج المغلوب. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: ينتج عن طريقة RVO أنواع مختلفة من الانسداد. (أ) صور قاع العين ل C57BL / 6J و iEC Casp9 WT و iEC Casp9 KO بعد 10 دقائق من التخثير الضوئي مع أنواع مختلفة من الانسداد: مسدود بالكامل ، مسدود جزئيا ، معاد تركيبه جزئيا ، وأعيد إحكامه بالكامل. تظهر الأجزاء الداخلية رؤية مركزة للوريد الذي أدى إلى نوع معين من الانسداد بعد التخثير الضوئي. (ب) القياس الكمي للنسبة المئوية للأوردة المسدودة في حالات الانسداد المختلفة لكل نمط وراثي خلال أول 10 دقائق بعد التشعيع. تم تقييم مقاطع الفيديو التي تبلغ مدتها عشر دقائق من قبل اثنين من الباحثين ، أعمى عن الأنماط الجينية ، والذين خصصوا أرقاما لحالات الانسداد المختلفة (مسدودة بالكامل (-2) ، ومسدودة جزئيا (-1) ، ومعاد إحكامها بالكامل (2) ، ومعاد إحراقها جزئيا (1)) لكل مدة. الاختصارات: RVO = انسداد الوريد الشبكي ؛ WT = نوع بري ؛ KO = خروج المغلوب. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: الجدول الزمني للإطباق بعد RVO. صور قاع العين الشبكية ل C57BL / 6J و iEC Casp9 WT و iEC Casp9 KO 0 و 5 دقائق و 10 دقائق و 24 ساعة بعد تشعيع الليزر. أول 10 دقائق حاسمة لحالة الانسدادات وقد تتغير بسرعة. بعد أول 10 دقائق ، تكون الانسدادات مستقرة حتى 24 ساعة على الأقل. تمثل الدوائر البيضاء الأوردة التي كان لها انسداد ناجح ، وتصور رؤوس الأسهم الصفراء نزيفا على شكل لهب. الاختصارات: RVO = انسداد الوريد الشبكي ؛ WT = نوع بري ؛ KO = خروج المغلوب. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: قد تحدث أمراض العيون المختلفة بعد RVO. (A-E) تظهر صور قاع العين والشبكية المقابلة (أ) مثال على عين غير مصابة لم تخضع لعملية RVO. ب: نزيف تحت الشبكية يظهر الدم المتسرب من الأوعية في صورة قاع العين. (ج) انفصال الشبكية الذي تشاهده الطية الضبابية في قاع العين ورفع الشبكية في OCT. (د) الوذمة المفرطة التي تظهر من خلال كمية كبيرة من التورم في OCT. (ه) عين إقفارية بالكامل مع ضعف تام في تدفق الدم مما يؤدي إلى شبكية بيضاء. (و) مثالان مختلفان لإعتام عدسة العين حيث لا يمكن الحصول على صورة قاع العين واضحة و OCT. قضبان مقياس OCT: 100 ميكرومتر. الاختصارات: RVO = انسداد الوريد الشبكي ؛ OCT = التصوير المقطعي للتماسك البصري. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 7: القياس الكمي لصور OCT. (أ) فحص سمك الطبقة و DRIL في عيون التحكم غير الليزرية والعيون التي مرت بإجراء RVO. قياسات GCL و IPL و INL و OPL و ONL والجزء الخارجي وقياسات شبكية العين بأكملها. الإحصائيات ، قيم اختبار مان ويتني: GCL: 0.0070 ، IPL: 0.0205 ، INL: <0.0001 ، OPL: 0.0014 ، ONL: 0.5582 ، الجزء الخارجي: 0.44852 ، شبكية العين بأكملها: 0.0019. تظهر أشرطة الخطأ SEM. (B) القياس الكمي DRIL المقاس من صور OCT من عناصر التحكم غير الليزرية وفئران RVO WT و KO iEC Casp9 بالإضافة إلى الفئران c57 / BL6J التي تحتوي على RVO. تظهر أشرطة الخطأ SEM. (C) مثال OCT مع تسميات كل طبقة شبكية. الاختصارات: DRIL = عدم تنظيم طبقات الشبكية الداخلية ؛ RVO = انسداد الوريد الشبكي ؛ WT = نوع بري ؛ KO = خروج المغلوب. GCL = طبقة خلية العقدة ؛ IPL = طبقة الضفيرة الداخلية ؛ INL = الطبقة النووية الداخلية ؛ OPL = طبقة الضفيرة الخارجية ؛ ONL = الطبقة النووية الخارجية ؛ SEM = الخطأ القياسي للمتوسط ؛ OCT = التصوير المقطعي للتماسك البصري ؛ NS = غير مهم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| خرج الليزر الأساسي (ميغاواط) | إخراج الليزر التجريبي الموصى به (mW) | التعرض للوقت الموصى به (مللي ثانية) |
| <11.0 أو >15.0 | قم بإيقاف تشغيل الليزر واضبط الألياف في النهاية المتصلة بصندوق التحكم بالليزر. قم بفكها وحركها قليلا نحو اليمين أو اليسار. قم بقياس النتيجة مرة أخرى ، حتى تصل إلى قيمة أعلى أو أقل. | |
| 11.0-12.0 | 120 | 1,000 |
| 12.0-13.0 | 110 | 1,000 |
| 13.0-14.0 | 100 | 1,000 |
| 14.0-15.0 | 100 | 1,000 |
الجدول 1: يمكن تعويض ناتج الليزر الأساسي المنخفض بإخراج ليزر تجريبي أعلى. الاختلافات في إخراج الليزر الأساسي وإخراج الليزر التجريبي الموصى به ووقت التعرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر نموذج RVO للماوس وسيلة لفهم أمراض RVO بشكل أكبر واختبار العلاجات المحتملة. بينما يستخدم نموذج الماوس RVO على نطاق واسع في هذا المجال ، هناك حاجة إلى بروتوكول تفصيلي حالي للنموذج يعالج تباينه ويصف تحسين النموذج. هنا ، نقدم دليلا بأمثلة من التجربة حول ما يمكن تغييره للحصول على النتائج الأكثر اتساقا عبر مجموعة من التجارب وتقديم بيانات موثوقة.
العنصران الأساسيان في نموذج الماوس RVO هما إخراج الليزر والحقن الوريدي الناجح لصبغة المحسس للضوء. لإنتاج الطاقة اللازمة للحث على التخثر عندما يستهدف الليزر وريدا معينا ، يجب ضبط إخراج الليزر بشكل صحيح. وفي حين يمكن تحقيق ذلك باستخدام التقنيات المقترحة في الطريقة، فمن المهم مراعاة الاختلافات في إعداد نظام كل مختبر. الاختلافات في كابل الألياف الضوئية وكيفية استيعابه فيما يتعلق بالمعدات ودرجة حرارة الغرفة هي بعض المتغيرات التي يمكن أن تفسر انخفاض إخراج الليزر. يوصى بإجراء عمليات ضبط مستقلة لإعداد النظام لزيادة إخراج الليزر.
ومع ذلك ، فإن هذا الجهد غير قابل للعمل بدون تقنية وريد الذيل المناسبة لتوصيل صبغة المحسسة للضوء. قد يكون من الصعب تحقيق حقن الوريد الذيل ، وهي مهارة تستغرق وقتا لتطويرها. يمكن أن يؤدي الحقن السيئ إلى عدم وجود انسداد. في هذه الحالة ، يمكن إعطاء Rose Bengal عبر IP. تم استخدام إدارة وردة البنغال عبر IP لنمذجة RVO ولكن مع وقت تشعيع ليزر أطول (3 ثوان) وتركيز أعلى من البنغال الوردي (40 مجم / مل)11. للحد من تشعيع الليزر لفترات طويلة واستهداف الأوعية الدموية على وجه التحديد ، فإن عروق الذيل هي الطريقة المفضلة للإدارة.
يمكن أيضا تحقيق هذا النموذج باستخدام أصباغ أخرى قابلة للتنشيط الضوئي مثل Y eosin وفلوريسئينالصوديوم 12،13،14 ، على الرغم من أن وردة البنغال هي الصبغة الأكثر استخداما للتنشيط الضوئي4،5،6،8. لقد ثبت أن جميع الأصباغ تنتج سمات مبكرة للأمراض السريرية مثل نزيف الشبكية وذمة الشبكية15. ثبت أن الأصباغ القابلة للتنشيط الضوئي ليس لها أي آثار ضارة على الحيوانات ، وبالتالي تظهر سمية ضئيلة للنظام15,16. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن الصبغة المختارة يجب أن يكون لها أقصى امتصاص متوافق مع الطول الموجي لليزر المستخدم. روز البنغال لديه إثارة عند 525 نانومتر17 ، فلوريسئين الصوديوم عند 475-490 نانومتر 18 ، و Y eosin عند 490 نانومتر19.
المصادر الرئيسية للتباين في هذا النموذج هي وقت الانسداد الضوئي بالنسبة لإدارة البنغال الوردي وخط الأساس وإخراج الليزر التجريبي. بينما يوضح الشكل 2 نقاطا زمنية مدتها 10 و 20 دقيقة لانسداد الصورة ، تم أيضا إجراء عدد صغير من التجارب التي تبلغ مدتها 5 و 15 دقيقة (البيانات غير معروضة) ، مما أدى إلى انسداد لم يكن متسقا مثل النقطة الزمنية البالغة 10 دقائق. لذلك ، تم اختيار 10 دقائق لتكون وقت الانتظار الأمثل بين إدارة البنغال الوردية وانسداد الصور لهذه الطريقة. ومع ذلك ، فقد أفادت الدراسات أنه يمكن أيضا تحفيز RVO في وقت مبكر من 3 دقائق بعد إعطاء وردة البنغال5. هناك طريقة أخرى لتحديد وقت الانتظار الأمثل الخاص بسلالة الفأر من البنغال الوردي إلى الانسداد الضوئي وهي مراقبة تركيز البنغال الوردي النسبي باستخدام وضع التصوير الفلوري مع مرشح رباعي ميثيل رودامين (TRITC). ومع ذلك ، يمكن إجراء البروتوكول الموصوف هنا باستخدام مجاهر تصوير الشبكية التي لا تحتوي على مرشح TRITC.
المصدر الآخر للتباين العالي في هذا النموذج هو إخراج الليزر الأساسي. نظرا لأن المستويات اليومية لإخراج الليزر الأساسي يمكن أن تكون مختلفة إلى حد كبير ، فمن المهم تقييم المستويات قبل كل تجربة. يمكن أن يساعد توحيد مخرجات الليزر الأساسية عبر الدراسات في تحفيز وتوسيع استخدام نموذج الماوس RVO. يمكن أن تكون إعادة ضبط كابل الألياف كافية لتعديل مستويات خط الأساس ؛ ومع ذلك ، إذا تعذر الوصول إلى قياس 13.0 ميجاوات ، فإن الجدول 1 يوفر دليلا للتعويض باستخدام القدرة التجريبية. من المهم ملاحظة أنه نظرا لأن شبكية العين عبارة عن نظام مغلق ، فإن تحديد جزء الأوردة المسدودة (عدد الأوردة المسدودة مقسوما على عدد الأوردة المشععة) أمر ضروري لفهم شدة الضرر في نموذج RVO والتحكم فيه والتنبؤ به. ارتبط التحليل السابق للقراءات التالفة (DRIL وسمك الشبكية) بجزء الأوردة المسدودة وضمور الشبكية المتوقع في 8 أيام بعد RVO8. وبالتالي ، ينبغي النظر في جزء من الأوردة المسدودة وتقييمها. لا يزال من غير الواضح كيف تساهم حالات الانسداد الوسيطة الأخرى ، مثل الانسداد الجزئي أو الانسداد الجزئي أو الأوردة التي كانت مسدودة وأعيد انسدادها لمدة 10 دقائق ، في تطور وذمة وضمور الشبكية.
يمكن أن تساعد الدراسات الإضافية للعيون مع هذه الأنواع من الانسدادات في التحقق مما إذا كان الانسداد المستمر ضروريا لأضرار جسيمة أو إذا كانت الانسدادات العابرة مهمة في هذا النموذج. اعتمادا على السؤال التجريبي الذي يتم طرحه ، ستكون معدلات الانسداد المختلفة هي الأمثل. يعتبر معدل الانسداد بنسبة 40-50٪ مثاليا في معظم الحالات ، مما يعني انسدادين أو ثلاثة في العين ذات ستة عروق. هذا يضمن إصابة كبيرة ، ولكن شبكية العين سليمة ويمكن تشريحها للتحليلات المناعية الكيميائية والكيميائية الحيوية.
لتحديد ذلك ، فإن التمييز بين النظرة المرضية لانسداد ناجح وتمثيلي لتوقيع RVO أمر مناسب. يشمل الانسداد الطبيعي الذي قدمه RVO نزيفا على شكل لهب 20 (يجب عدم الخلط بينه وبين نزيف تحت الشبكية) ، والذي يمكن ملاحظته في هذا النموذج بعد24 ساعة من الإصابة. يمكن أن يؤدي نموذج RVO أيضا إلى إصابات شبكية غير مرغوب فيها (غير مميزة لأمراض RVO) مثل تلك الموضحة في الشكل 6B-F ، إذا لم يتم التحكم في معلماته بحذر. النهج الذي يمكن اتباعه لتجنب ذلك ، إلى جانب تنظيم تركيز البنغال الوردي وقوة الليزر التجريبية ، هو التوقف عن تشعيع الأوعية التي لديها تشكيل واضح للخثرة بعد التشعيع الأول أو الثاني.
العوامل الأخرى التي يجب مراعاتها عند استخدام هذا النموذج وتحديد الأوردة التي يجب إغلاقها هي سلالة الفأر وقطر الوعاء. بعض سلالات الفئران ، مثل BALB / c ، والمعروفة باسم ألبينو ، عرضة للتلف الخفيف21. بالإضافة إلى ذلك ، لديهم عجز في نمو الشبكية يؤدي إلى عيوب في الارتباك في chiasm البصري وحدة البصر22,23. يوصى بإجراء تقييم كامل لسلامة الشبكية والأوعية الدموية القاعدية للضوابط غير المصابة لسلالة الفأر المختارة لدراسات RVO. أظهرت الدراسات أن عرض الوريد يمكن أن يتداخل مع تطور وذمة الشبكية وأمراض الأمراض24. وبالتالي ، ينبغي استخدام الحيوانات ذات الوزن المماثل لتجنب المزيد من التباين. تعتمد عوامل الاستبعاد التي يجب استخدامها في الدراسة أيضا على السؤال التجريبي. قد يكون من الحكمة تضمين أي عين كانت مسدودة مرة واحدة ، حتى لو تم إعادة إحداثها في نقطة وقت المتابعة للإشارة. ومع ذلك ، إذا كانت هناك رغبة في انسداد مستقر ، استبعاد هذه العيون. يوضح الشكل 6 أمثلة على معايير الاستبعاد المحتملة أو العيون التي يمكن استخدامها للتحليل المرضي.
لإظهار أن إعدادات الليزر هذه لم تسبب ضررا وأن التأثيرات التي شوهدت كانت مدفوعة حقا بالانسداد نفسه ، تم إجراء ضوابط زائفة في الدراسات السابقة8. لا تزال الفئران الوهمية تتلقى حقنة الوريد الذيل من البنغال الوردي ولكن تم تشعيعها في الفضاء المتني بين الأوعية الرئيسية بدلا من تشعيعها على الوريد. كانت هذه خطوة مهمة في ضمان أن النموذج يكرر إصابات RVO التي شوهدت في المرضى بدلا من مجرد إصابة الأنسجة بالليزر. لا تظهر هذه القشور أي تنشيط ل caspase-9 أو -7 أو أي من الوذمة التي شوهدت في الفئران التي تلقت تشعيعا طبيعيا بالليزر على الأوعية ، مما يشير إلى أن الليزر لم يكن له أي آثار ضارة. يعد وجود عناصر التحكم هذه أمرا ضروريا ، خاصة إذا كان سيتم استخدام إعدادات ليزر أعلى للتأكد من أن الإصابة التي يتم نمذجتها هي تمثيل دقيق للضرر المطلوب8.
يمكن تطبيق نموذج الماوس RVO لدراسة الأمراض الأخرى التي تنتج عن إصابات نقص التأكسج الإقفاري في شبكية العين والدماغ مثل اعتلال الشبكية السكري واعتلال الشبكية الخداجي والسكتة الدماغية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يكون بمثابة نموذج لدراسة مسارات الإشارات ذات الصلة بتطور إصابة الأوعية الدموية واختبار العلاجات المحتملة التي تخفف من التنكس العصبي في الجهاز العصبي المركزي. يمكن أن يحد التحسين المصمم في هذا التقرير من التباين في نموذج RVO للماوس ويلقي الضوء على الفيزيولوجيا المرضية ل RVO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen | Rimadyl | NADA #141-199 | keep at 4 °C |
| Corn Oil | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| Fiber Patch Cable | Thor Labs | M14L02 | |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Lasercheck | Coherent | 1098293 | |
| Phenylephrine | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
| Phoneix Micron IV with Meridian, StreamPix, and OCT modules | Phoenix Technology Group | ||
| Proparacaine Hydrochloride | Akorn | NDC: 17478-263-12 | keep at 4 °C |
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-5G | light-sensitive |
| Tropicamide | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
- Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors. Journal of Global Health. 9 (1), 010427 (2019).
- Ehlers, J. P., Fekrat, S. Retinal vein occlusion: beyond the acute event. Survey of Ophthalmology. 56 (4), 281-299 (2011).
- Iftikhar, M., et al. Loss of peak vision in retinal vein occlusion patients treated for macular edema. American Journal of Ophthalmology. 205, 17-26 (2019).
- Zhang, H., et al. Development of a new mouse model of branch retinal vein occlusion and retinal neovascularization. Japanese Journal of Ophthalmology. 51 (4), 251-257 (2007).
- Ebneter, A., Agca, C., Dysli, C., Zinkernagel, M. S. Investigation of retinal morphology alterations using spectral domain optical coherence tomography in a mouse model of retinal branch and central retinal vein occlusion. PLoS One. 10 (3), 0119046 (2015).
- Fuma, S., et al. A pharmacological approach in newly established retinal vein occlusion model. Scientific Reports. 7, 43509 (2017).
- Zhang, C., et al. Activation of microglia and chemokines in light-induced retinal degeneration. Molecular Vision. 11, 887-895 (2005).
- Avrutsky, M. I., et al. Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion. Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).
- Nicholson, L., et al. Diagnostic accuracy of disorganization of the retinal inner layers in detecting macular capillary non-perfusion in diabetic retinopathy. Clinical & Experimental Ophthalmology. 43 (8), 735-741 (2015).
- Moein, H. R., et al. Optical coherence tomography angiography to detect macular capillary ischemia in patients with inner retinal changes after resolved diabetic macular edema. Retina. 38 (12), 2277-2284 (2018).
- Hirabayashi, K., et al. Development of a novel model of central retinal vascular occlusion and the therapeutic potential of the adrenomedullin-receptor activity-modifying protein 2 system. American Journal of Pathology. 189 (2), 449-466 (2019).
- Martin, G., Conrad, D., Cakir, B., Schlunck, G., Agostini, H. T. Gene expression profiling in a mouse model of retinal vein occlusion induced by laser treatment reveals a predominant inflammatory and tissue damage response. PLoS One. 13 (3), 0191338 (2018).
- Drechsler, F., et al. Effect of intravitreal anti-vascular endothelial growth factor treatment on the retinal gene expression in acute experimental central retinal vein occlusion. Ophthalmic Research. 47 (3), 157-162 (2012).
- Genevois, O., et al. Microvascular remodeling after occlusion-recanalization of a branch retinal vein in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (2), 594-600 (2004).
- Khayat, M., Lois, N., Williams, M., Stitt, A. W.
- Nguyen, V. P., Li, Y., Zhang, W., Wang, X., Paulus, Y. M. High-resolution multimodal photoacoustic microscopy and optical coherence tomography image-guided laser induced branch retinal vein occlusion in living rabbits. Scientific Reports. 9 (1), 10560 (2019).
- Sayyed, S. A. A. R., Beedri, N. I., Kadam, V. S., Pathan, H. M. Rose Bengal sensitized bilayered photoanode of nano-crystalline TiO2-CeO2 for dye-sensitized solar cell application. Applied Nanoscience. 6 (6), 875-881 (2015).
- Emmart, E. W. Observations on the absorption spectra of fluorescein, fluorescein derivatives and conjugates. Archives of Biochemistry and Biophysics. 73 (1), 1-8 (1958).
- Yu, L., Liu, Z., Liu, S., Hu, X., Liu, L. Fading spectrophotometric method for the determination of polyvinylpyrrolidone with eosin Y. Chinese Journal of Chemistry. 27 (8), 1505-1509 (2009).
- MacDonald, D. The ABCs of RVO: a review of retinal venous occlusion. Clinical & Experimental Optometry. 97 (4), 311-323 (2014).
- Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
- LaVail, M. M., Gorrin, G. M., Repaci, M. A. Strain differences in sensitivity to light-induced photoreceptor degeneration in albino mice. Current Eye Research. 6 (6), 825-834 (1987).
- Jeffery, G. The albino retina: an abnormality that provides insight into normal retinal development. Trends in Neurosciences. 20 (4), 165-169 (1997).
- Kinnear, P. E., Jay, B., Witkop, C. J.
- Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
