Summary
यहां, हम गुलाब बंगाल का उपयोग करके रेटिना नस रोड़ा के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल और आनुवंशिक रूप से संशोधित उपभेदों में इसकी प्रजनन क्षमता को अधिकतम करने के लिए सिफारिशों के साथ लेजर-निर्देशित रेटिना इमेजिंग माइक्रोस्कोप सिस्टम का वर्णन करते हैं।
Abstract
रेटिना नस रोड़ा (आरवीओ) के माउस मॉडल का उपयोग अक्सर नेत्र विज्ञान में तंत्रिका रेटिना में हाइपोक्सिक-इस्केमिक चोट का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। इस रिपोर्ट में, विभिन्न आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस उपभेदों में लगातार सफल रोड़ा दर प्राप्त करने के लिए अनुकूलन के लिए सिफारिशों के साथ महत्वपूर्ण कदमों को इंगित करने वाली एक विस्तृत विधि प्रदान की जाती है। आरवीओ माउस मॉडल में मुख्य रूप से एक फोटोसेंसिटाइज़र डाई का अंतःशिरा प्रशासन होता है, जिसके बाद एक नेत्र निर्देशित लेजर से जुड़े रेटिना इमेजिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके लेजर फोटोकोग्यूलेशन होता है। तीन चर को रोड़ा स्थिरता के निर्धारकों के रूप में पहचाना गया था। गुलाब बंगाल प्रशासन के बाद प्रतीक्षा समय को समायोजित करके और बेसलाइन और प्रयोगात्मक लेजर आउटपुट को संतुलित करके, प्रयोगों में परिवर्तनशीलता को सीमित किया जा सकता है और अवरोधों की उच्च सफलता दर प्राप्त की जा सकती है। इस विधि का उपयोग रेटिना रोगों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जो रेटिना एडिमा और हाइपोक्सिक-इस्केमिक चोट की विशेषता है। इसके अतिरिक्त, जैसा कि यह मॉडल संवहनी चोट को प्रेरित करता है, इसे न्यूरोवास्कुलचर, न्यूरोनल मृत्यु और सूजन का अध्ययन करने के लिए भी लागू किया जा सकता है।
Introduction
रेटिना नस रोड़ा (आरवीओ) एक आम रेटिना संवहनी रोग है जिसने 2015 में दुनिया भर में लगभग 28 मिलियनलोगों को प्रभावित किया। आरवीओ कामकाजी वृद्ध वयस्कों और बुजुर्गों में दृष्टि में गिरावट और हानि की ओर जाता है, जो अनुमानित दशक में बढ़ने वाली चल रही दृष्टि-धमकी देने वाली बीमारी का प्रतिनिधित्व करता है। आरवीओ के कुछ विशिष्ट विकृतियों में हाइपोक्सिक-इस्केमिक चोट, रेटिना एडिमा, सूजन और न्यूरोनल हानि2 शामिल हैं। वर्तमान में, इस विकार के लिए उपचार की पहली पंक्ति संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीईजीएफ) अवरोधकों के प्रशासन के माध्यम से है। जबकि एंटी-वीईजीएफ उपचार ने रेटिना एडिमा को सुधारने में मदद की है, कई रोगियों को अभी भी दृष्टि गिरावट का सामना करना पड़ताहै। इस बीमारी के पैथोफिज़ियोलॉजी को और समझने और उपचार की संभावित नई लाइनों का परीक्षण करने के लिए, विभिन्न माउस उपभेदों के लिए एक कार्यात्मक और विस्तृत आरवीओ माउस मॉडल प्रोटोकॉल का गठन करने की आवश्यकता है।
माउस मॉडल मानव रोगियों में उपयोग किए जाने वाले एक ही लेजर डिवाइस को लागू करने के लिए विकसित किए गए हैं, जो माउस के लिए सही आकार में स्केल किए गए इमेजिंग सिस्टम के साथ जोड़ा गया है। आरवीओ के इस माउस मॉडल को पहली बार 20074 में रिपोर्ट किया गया था और आगे एब्नेटर और अन्य 4,5 द्वारा स्थापित किया गया था। आखिरकार, मॉडल को फ्यूमा एट अल द्वारा रेटिना एडिमा6 जैसे आरवीओ के प्रमुख नैदानिक अभिव्यक्तियों को दोहराने के लिए अनुकूलित किया गया था। चूंकि मॉडल को पहली बार रिपोर्ट किया गया था, इसलिए कई अध्ययनों ने इसे लेजर के साथ प्रमुख रेटिना नसों के फोटोकोग्यूलेशन के बाद फोटोसेंसिटाइज़र डाई के प्रशासन का उपयोग करके नियोजित किया है। हालांकि, प्रशासित डाई की मात्रा और प्रकार, लेजर शक्ति और एक्सपोजर का समय इस पद्धति का उपयोग करने वाले अध्ययनों में काफी भिन्न होता है। ये अंतर अक्सर मॉडल में परिवर्तनशीलता में वृद्धि कर सकते हैं, जिससे इसे दोहराना मुश्किल हो जाता है। आज तक, इसके अनुकूलन के लिए संभावित रास्तों के बारे में विशिष्ट विवरण के साथ कोई प्रकाशित अध्ययन नहीं हैं।
यह रिपोर्ट C57BL/6J स्ट्रेन में RVO माउस मॉडल की एक विस्तृत पद्धति और C57BL/6J पृष्ठभूमि के साथ एक टैमोक्सीफेन-इंड्यूसेबल एंडोथेलियल कैस्पेज़ -9 नॉकआउट (iEC Casp9KO) तनाव और आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस के लिए संदर्भ तनाव के रूप में RVO पैथोलॉजी के लिए प्रासंगिकता प्रस्तुत करती है। एक पिछले अध्ययन से पता चला था कि एंडोथेलियल कैसपेज़ -9 का गैर-एपोप्टोटिक सक्रियण रेटिना एडिमा को उकसाता है और न्यूरोनल मृत्यु को बढ़ावा देताहै। इस तनाव का उपयोग करने के अनुभव ने आरवीओ माउस मॉडल को तैयार करने के लिए संभावित संशोधनों की दिशा में अंतर्दृष्टि निर्धारित करने और प्रदान करने में मदद की, जो अन्य आनुवंशिक रूप से संशोधित उपभेदों पर लागू हो सकता है।
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Protocol
यह प्रोटोकॉल नेत्र और दृष्टि अनुसंधान में जानवरों के उपयोग के लिए एसोसिएशन फॉर रिसर्च इन विजन एंड ओप्थाल्मोलॉजी (एआरवीओ) बयान का पालन करता है। कृंतक प्रयोगों को कोलंबिया विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित और निगरानी की गई थी।
नोट: सभी प्रयोगों में दो महीने के नर चूहों का उपयोग किया गया था जिनका वजन लगभग 20 ग्राम था।
1. फ्लोक्सिड जीन के इंड्यूसेबल जेनेटिक एब्लेशन के लिए टैमोक्सीफेन की तैयारी और प्रशासन
नोट: रेटिना पोत व्यास जानवर के वजन से प्रभावित हो सकता है। सुनिश्चित करें कि एक प्रयोग के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी जानवर समान वजन के हैं।
- मकई के तेल में टैमोक्सीफेन को 20 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता तक पतला करें।
नोट: टैमोक्सीफेन एक विषाक्त है और प्रकाश-संवेदनशील है। प्रकाश से रक्षा करें, उदाहरण के लिए, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ। - भंवर कुछ सेकंड के लिए समाधान है।
- ओवन में 15 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
नोट: सुनिश्चित करें कि टैमोक्सीफेन पूरी तरह से भंग हो गया है। अतिरिक्त भंवर आवश्यक हो सकता है। - समाधान को 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- टैमोक्सीफेन इंजेक्शन के लिए 26 ग्राम सुई के साथ फिट 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करें। इंजेक्शन क्षेत्र को 70% इथेनॉल के साथ साफ करें। विशिष्ट इंड्यूसेबल क्रे लाइन के अनुसार स्थापित समय के लिए प्रतिदिन 2 मिलीग्राम टैमोक्सीफेन (20 मिलीग्राम / एमएल का 100 μL) इंट्रापरिटोनियल (आईपी) का प्रबंधन करें।
- प्रयोगशुरू करने से पहले जानवरों के लिए दो दिनों के आराम की अनुमति दें।
2. लेजर फोटोकॉग्यूलेशन के लिए अभिकर्मकों की तैयारी
- गुलाब बंगाल
नोट: गुलाब बंगाल प्रकाश-संवेदनशील है। उपयोग होने तक अंधेरे में स्टोर करें और सर्वोत्तम परिणामों के लिए ताजा तैयार करें।- बाँझ खारा में 5 मिलीग्राम / एमएल तक पतला करके गुलाब बंगाल तैयार करें और इसे 0.2 μm सिरिंज फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें।
- गुलाब की बंगाल के साथ 26 ग्राम सुई से सुई युक्त 1 एमएल सिरिंज तैयार करें।
- केटामाइन/
- निम्नलिखित सांद्रता के लिए बाँझ खारा में पतला केटामाइन और ज़ाइलाज़िन: केटामाइन (80-100 मिलीग्राम / किग्रा) और ज़ाइलाज़िन (5-10 मिलीग्राम / किग्रा)।
- Carprofen
- बाँझ खारा में 1 मिलीग्राम / एमएल तक कारप्रोफेन पतला करें।
- कारप्रोफेन के साथ 26 ग्राम सुई से सुसज्जित 1 एमएल सिरिंज तैयार करें।
- बाँझ खारा
- बाँझ खारा के साथ 26 ग्राम सुई के साथ सुई से सुसज्जित 5 एमएल सिरिंज तैयार करें।
3. लेजर सेटअप
- धीरे से फाइबर ऑप्टिक केबल को संभालें और इसे लेजर नियंत्रण बॉक्स और रेटिना इमेजिंग माइक्रोस्कोप के लेजर एडाप्टर से कनेक्ट करें।
- रेटिना इमेजिंग माइक्रोस्कोप लैंप बॉक्स चालू करें।
- कंप्यूटर चालू करें और इमेजिंग प्रोग्राम खोलें।
- सफेद कागज के एक टुकड़े का उपयोग करके सफेद संतुलन समायोजित करें और इसे माउस आंख के टुकड़े के सामने रखें और इमेजिंग प्रोग्राम में समायोजित करें पर क्लिक करें।
- कुंजी को चालू करके और लेजर नियंत्रण बॉक्स की स्क्रीन पर दिए गए निर्देशों का पालन करके लेजर नियंत्रण बॉक्स को चालू करें।
नोट: इस प्रयोग में उपयोग किया जाने वाला लेजर कक्षा 3 बी है और आंखों को नुकसान पहुंचा सकता है। लेजर संचालित करते समय सुरक्षात्मक चश्मे पहनें। - बेसलाइन लेजर पावर की जाँच करें।
- एक लेजर पावर मीटर का उपयोग करें।
- लेजर नियंत्रण बॉक्स की स्क्रीन को निम्नलिखित मापदंडों पर समायोजित करें: 50 mW और 2,000 ms।
- लेजर चालू करें और पावर मीटर को आईपीस के सामने रखें।
नोट: सुनिश्चित करें कि बेसलाइन लेजर पावर का परीक्षण करते समय माइक्रोस्कोप प्रकाश बंद है। - लेजर को सक्रिय करने के लिए फुटस्विच पेडल दबाएं।
- लेजर पावर रीडआउट के लिए 13-15 मेगावाट होने का लक्ष्य रखें।
नोट: लेजर पावर रीडआउट रेटिना नस रोड़ा के लिए सफलता दर निर्धारित करेगा। यदि लेजर पावर रीडआउट बहुत कम है, तो लेजर एक्सपोज़र की शक्ति और समय में समायोजन किया जा सकता है। सिफारिशों के लिए तालिका 1 देखें।
- निम्नलिखित मापदंडों के लिए लेजर नियंत्रण बॉक्स की स्क्रीन सेट करके प्रयोगात्मक लेजर शक्ति समायोजित करें: 100 mW, 1,000 ms।
- लेजर बंद कर दें।
नोट: सुरक्षा के लिए और ओवरहीटिंग को रोकने के लिए, चूहों के बीच लेजर को बंद रखना सबसे अच्छा है।
4. गुलाब बंगाल का माउस टेल नस इंजेक्शन
- 500 एमएल बीकर में 300 एमएल पानी डालें।
- बीकर को माइक्रोवेव ओवन में 1 मिनट के लिए गर्म करें।
- बीकर में गर्म पानी में धुंध डालें।
- माउस को एक निरोधक में रखें।
- धुंध को माउस पूंछ में धीरे से दबाएं और फैली हुई नसों की तलाश करें। गर्म पानी के फैलाव के बाद अल्कोहल वाइप का उपयोग करके इंजेक्शन साइट को कीटाणुरहित करें।
- सुई को इंजेक्शन साइट में डालें और यह सुनिश्चित करने के लिए सिरिंज पर खींचें कि आप नस में हैं। फिर, माउस पूंछ की नस को इंजेक्ट करें, जानवर के वजन (37.5 मिलीग्राम / किग्रा) के अनुसार सही मात्रा का प्रशासन करें। हेमेटोमा या रक्तस्राव से बचने के लिए इंजेक्शन साइट पर दबाव लागू करें। साइट को पोंछ ें।
- निरोधक से माउस छोड़ दें और इसे पिंजरे में वापस कर दें।
- एनेस्थेटिक्स के इंजेक्शन से पहले गुलाब की बंगाल को प्रसारित करने के लिए 8 मिनट की अनुमति दें।
नोट: यह गुलाब बंगाल इंजेक्शन और लेजर विकिरण के बीच कुल 10 मिनट प्रदान करेगा।
5. प्रमुख नसों का रोड़ा
- गर्म माउस प्लेटफ़ॉर्म चालू करें।
- प्रत्येक आंख में फेनिलफ्राइन और ट्रॉपिकामाइड की एक बूंद जोड़ें।
- एनेस्थेटिक्स, केटामाइन (80-100 मिलीग्राम / किग्रा) और ज़ाइलज़िन (5-10 मिलीग्राम / किग्रा) आईपी के 150 μL इंजेक्ट करें।
नोट: इस प्रक्रिया के दौरान, माउस को दो आईपी इंजेक्शन दिए गए थे। इसलिए, पक्षों को वैकल्पिक रूप से रखा गया था। संज्ञाहरण के लिए आईपी इंजेक्शन निचले दाएं पेट के चतुर्थांश में दिया गया था, और खारा निचले बाएं पेट के चतुर्थांश में इंजेक्ट किया गया था। इंजेक्शन लगाने से पहले सिरिंज पर खींचने की सिफारिश यह सुनिश्चित करने के लिए की जाती है कि सुई पेट में है और किसी भी अंग में नहीं है। - एनेस्थीसिया की गहराई निर्धारित करने के लिए जानवर को टो-पिंच करें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि यह अनुत्तरदायी न हो।
- प्रति आंख (एनाल्जेसिक) प्रोपैराकेन हाइड्रोक्लोराइड की एक बूंद जोड़ें।
- दोनों आंखों में जेल मरहम जोड़ें।
- कानों के बीच 150 μL कारप्रोफेन को चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें।
- प्लेटफ़ॉर्म पर माउस समायोजित करें।
- जब तक रेटिना फंडस का दृश्य स्पष्ट और केंद्रित न हो, तब तक प्लेटफ़ॉर्म को समायोजित करें।
- रेटिना नसों की गणना करें और फंडस की एक छवि लें।
नोट: रेटिना नसें धमनियों की तुलना में गहरे और व्यापक होती हैं। नसों और धमनियों वैकल्पिक; हालांकि, कभी-कभी ऑप्टिक तंत्रिका के करीब एक शाखित धमनी हो सकती है, और इसलिए, दो आसन्न धमनियां हो सकती हैं। - लेजर चालू करें और ऑप्टिक डिस्क से लगभग 375 μm पर रेटिना नस की ओर लक्ष्य रखें।
- पैर की खुजली को दबाकर और लेजर बीम को 100 μm तक थोड़ा स्थानांतरित करके पोत को विकिरणित करें। इस चरण को तीन बार दोहराएं और प्रत्येक पल्स के बाद लेजर बीम को स्थानांतरित करें ताकि विकिरण एक स्थान पर केंद्रित न हो।
- 2-3 अवरोधों को प्राप्त करने के लिए अन्य प्रमुख जहाजों पर विकिरण दोहराएं।
6. 0 वें दिन अवरुद्ध नसों की संख्या स्थापित करना
- जहाजों को विकिरणित करने के बाद दीपक बंद करें और 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
नोट: प्रकाश जोखिम रेटिना क्षति और सूजन का कारण बन सकता है; एक्सपोजर को कम करने के लिए प्रतीक्षा समय के दौरान दीपक बंद करें। - दीपक को वापस चालू करें और अवरुद्ध नसों की संख्या की गणना करें।
- फंडस की एक छवि लें।
7. आफ्टरकेयर
- बाँझ खारा आईपी के 1 एमएल इंजेक्ट करें।
नोट: अनुभाग 5, चरण 3 में आईपी इंजेक्शन विवरण देखें। - दोनों आंखों में स्नेहक आंखों की बूंदें जोड़ें।
- दोनों आंखों में जेल मरहम जोड़ें।
- माउस को देखें क्योंकि यह संज्ञाहरण से ठीक हो जाता है, और पूरी तरह से ठीक होने तक इसे अन्य जानवरों के साथ पिंजरे में वापस न करें। कारप्रोफेन (5 मिलीग्राम / किग्रा) प्रक्रिया के 2 दिनों तक दैनिक दिया जा सकता है। यदि मनुष्यों पर लागू किया जाता है, तो दर्द आरवीओ का लक्षण नहीं है।
नोट: जानवरों को तब तक लावारिस न छोड़ें जब तक कि वे संज्ञाहरण से पूरी तरह से ठीक न हो जाएं।
8. ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी (ओसीटी) द्वारा रेटिना एडिमा का आकलन
नोट: यह कदम अन्वेषक के समय बिंदु पर किया जा सकता है। C57BL/6J माउस के लिए रेटिना एडिमा का चरम RVO प्रक्रिया के 1 दिन बाद होता है। यह समय बिंदु माउस की पृष्ठभूमि के आधार पर भिन्न हो सकता है।
- रेटिना इमेजिंग माइक्रोस्कोप लाइट बॉक्स, ओसीटी मशीन और गर्म माउस प्लेटफॉर्म चालू करें।
- रोड़ा के अगले दिन, जानवर को तैयार करने के लिए चरण 5.2 से 5.7 का पालन करें।
- इमेजिंग और OCT सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम खोलें।
- OCT प्रोग्राम में, नज को 5 में समायोजित करें।
- जलने से 75 μm दूर पर OCT लें या 4 क्लिक करें।
- रेटिना के चार चतुर्थांशों पर ओसीटी छवियां लें।
- ट्रेसिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके OCT छवियों का विश्लेषण करें।
- पूर्व-विकिरणित उपायों की रेटिना मोटाई की तुलना आरवीओ के बाद या रुचि के समय 1 दिन से करें।
नोट: डेटा का विश्लेषण करते समय, विकिरणित नसों की संख्या को ध्यान में रखें क्योंकि यह रेटिना एडिमा के विकास को प्रभावित कर सकता है। जानवरों को तब एनेस्थेटिक का प्रशासन करके इच्छामृत्यु दी जाती है, जिसके बाद छिड़काव गैर-जीवित सर्जरी होती है।
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Representative Results
आरवीओ माउस मॉडल का उद्देश्य रेटिना नसों में अवरोधों को सफलतापूर्वक प्राप्त करना है, जिससे हाइपोक्सिक-इस्केमिक चोट, रक्त रेटिना बाधा का टूटना, न्यूरोनल मृत्यु और रेटिना एडिमा8 हो सकता है। चित्रा 1 प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए चरणों की एक समयरेखा दिखाता है, प्रयोगात्मक डिजाइन का एक योजनाबद्ध, और उन चरणों की रूपरेखा तैयार करता है जिन्हें प्रयोगात्मक प्रश्नों के आधार पर आगे अनुकूलित किया जा सकता है। तीन मुख्य चरण जिन्हें संशोधित किया जा सकता है, वे गुलाब बंगाल प्रशासन के बाद प्रतीक्षा समय, बेसलाइन लेजर पावर और प्रयोगात्मक लेजर आउटपुट हैं। इस रिपोर्ट में, सी 57बीएल / 6 जे चूहों, साथ ही एक इंड्यूसेबल एंडोथेलियल सेल कैसपेज़ -9 नॉकआउट माउस लाइन (आईईसी कैस्प 9) से डब्ल्यूटी और केओ लिटरमेट्स का उपयोग विभिन्न उपभेदों में इष्टतम सेटिंग्स निर्धारित करने के लिए किया गया था।
गुलाब बंगाल इंजेक्शन से लेजर विकिरण तक प्रतीक्षा समय नसों में फोटोकोग्यूलेशन की सफलता को बदल सकता है। बहुत कम प्रतीक्षा समय के परिणामस्वरूप नसों के भीतर गुलाब बंगाल एकाग्रता कम हो सकती है, जबकि बहुत लंबे समय तक प्रतीक्षा करने से रेटिना परिसंचरण से गुलाब बंगाल साफ हो सकता है। दोनों स्थितियों में खराब फोटोकोग्यूलेशन और असफल रोड़ा हो सकता है। लेजर विकिरण के तुरंत बाद प्राप्त अवरोधों की संख्या का परीक्षण करते समय, गुलाब बंगाल प्रशासन के 10 और 20 मिनट बाद लेजर किए गए जानवरों की तुलना करने से पता चला कि प्राप्त अवरोधों की संख्या में कोई अंतर नहीं था (चित्रा 2 बी)। हालांकि, आरवीओ के बाद 1 दिन तक बने रहने वाले अवरोधों की संख्या उन जानवरों में काफी कम हो गई, जिन्हें जीनोटाइप से स्वतंत्र रूप से बंगाल प्रशासन के 20 मिनट बाद लेजर किया गया था। इस परिणाम से पता चलता है कि तीव्र आरवीओ-प्रेरित चोट का अध्ययन करते समय, गुलाब बंगाल प्रशासन के बाद प्रतीक्षा समय रोड़ा स्थिरता को प्रभावित कर सकता है। नसों का प्रारंभिक पुनरुत्पादन (चोट के 24 घंटे बाद से पहले) रेटिना एडिमा के विकास को प्रभावित कर सकता है और इसलिए, गुलाब बंगाल प्रशासन से लेजर विकिरण तक सही प्रतीक्षा समय निर्धारित करके नियंत्रित किया जाना चाहिए।
सिद्धांत रूप में, सफल फोटोकोग्यूलेशन जो रोड़ा की ओर जाता है लेजर शक्ति द्वारा संचालित होता है। यद्यपि यह प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है, यह मॉडल में परिवर्तनशीलता के सबसे बड़े स्रोतों में से एक है और इसे स्थिरता के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। इसे पूरा करने के लिए, चूहों को गुलाब बंगाल के साथ इंजेक्शन देने से पहले सेटअप के दौरान लेजर आउटपुट को मापने की सिफारिश की जाती है। बेसलाइन लेजर पावर के लिए अनुशंसित आउटपुट 13.0 और 15.0 मेगावाट के बीच है। प्रयोगात्मक शक्ति (100 mW) को संशोधित किए बिना 11.5 mW जैसी कम बेसलाइन लेजर शक्ति के परिणामस्वरूप कोई अवरोध नहीं हुआ, जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है। इसके विपरीत, 100 मेगावाट की प्रयोगात्मक शक्ति के साथ 13.5 मेगावाट के बेसलाइन लेजर आउटपुट के परिणामस्वरूप सफल अवरोध उत्पन्न हुए। ऐसे मामलों में जहां लेजर आउटपुट 13.0 मेगावाट से नीचे था, प्रयोगात्मक शक्ति को उच्च बेसलाइन लेजर आउटपुट के समान सफल रोड़ा प्राप्त करने के लिए 110 मेगावाट तक बढ़ा दिया गया था। आमतौर पर, 100 mW मानक प्रयोगात्मक शक्ति है; हालांकि, यदि लेजर आउटपुट 13.0 mW से नीचे है, तो तालिका 1 में अनुशंसित श्रेणियों के साथ प्रयोगात्मक शक्ति को संशोधित करके इसकी भरपाई की जा सकती है।
नसों के लेजर फोटोकॉग्यूलेशन के बाद चार मुख्य प्रकार के रोड़ा होने का उल्लेख किया गया है। इस प्रकार के रोड़ा को चित्रा 4 ए में संक्षेपित किया गया है और रक्त प्रवाह की मात्रा के अनुसार वर्गीकृत किया गया है; पूरी तरह से अवरुद्ध वाहिकाएं (कोई रक्त प्रवाह नहीं), आंशिक रूप से अवरुद्ध वाहिकाएं (ज्यादातर कभी-कभी प्रवाह के साथ अवरुद्ध), आंशिक रूप से पुन: संक्रमित (बाधा के साथ निर्बाध स्थिर रक्त प्रवाह), और पूरी तरह से पुन: संक्रमित वाहिकाएं (कोई स्पष्ट बाधा नहीं)। यह जांचने के लिए कि क्या रोड़ा के प्रकार जीनोटाइप के अनुसार बदलते हैं और प्रति रोड़ा अवस्था में बिताए गए समय को निर्धारित करते हैं, लेजर विकिरण के बाद 10 मिनट के वीडियो का मूल्यांकन किया गया था। इस मूल्यांकन ने यह निर्धारित करने में मदद की कि आईईसी कैस्प 9 चूहों के विकिरणित वाहिका सी 57बीएल 6 / जे की तुलना में आंशिक रूप से पुन: संक्रमित और आंशिक रूप से अवरुद्ध राज्यों में अधिक समय बिताते हैं, जो पूरी तरह से अवरुद्ध राज्यों में अधिक समय बिताते हैं (चित्रा 4 बी)।
चित्रा 5 दर्शाता है कि लेजर फोटोकोग्यूलेशन के बाद पहले 10 मिनट के भीतर जहाजों की रोड़ा स्थिति तेजी से कैसे बदलती है। एक बार जब ये प्रारंभिक 10 मिनट बीत जाते हैं, तो रोड़ा स्थिर हो जाता है और 24 घंटे के समय बिंदु तक बनाए रखा जाता है। इस प्रकार, प्रति आंख रोड़ा की सटीक प्रारंभिक संख्या का आकलन करने के लिए, विकिरण के बाद 10 मिनट तक इंतजार करने की सिफारिश की जाती है। इस मॉडल के पिछले मूल्यांकन ने निर्धारित किया कि विकिरण 8 के बाद अधिकांश रोड़ा 8 दिनों तक पुन: उत्पन्नहोते हैं; हालांकि, प्रति दिन पुनरावृत्ति करने वाले रोड़ा की दर तनाव से भिन्न हो सकती है और प्रत्येक प्रयोगात्मक मॉडल में निर्धारित की जानी चाहिए। यहां प्रस्तुत मॉडल तीव्र चोट का है और इसका उपयोग उन मार्गों को समझने के लिए किया जाना है जो एडिमा की ओर ले जाते हैं, जो रोड़ा के बाद 24 घंटे के भीतर विकसित होता है। आरवीओ की एक अन्य विशेषता लौ के आकार के रक्तस्राव है, जिसे चोट के बाद 24 घंटे में देखा जा सकता है, जैसा कि चित्र 5 में दर्शाया गया है।
24 घंटे के बाद आरवीओ पर फॉलो-अप अन्य नेत्र रोगों को प्रकट कर सकता है जो आरवीओ विधि के परिणामस्वरूप हो सकते हैं। कुछ में सबरेटिनल हेमरेज (निरंतर रक्त पैच की विशेषता), रेटिना डिटेचमेंट, पूरी तरह से इस्केमिक रेटिना (नसों और धमनियों में कोई रक्त प्रवाह नहीं) और मोतियाबिंद शामिल हैं। चित्रा 6 इन आंखों को छोड़कर जहां मोतियाबिंद बनता है (चित्रा 6 एफ), क्योंकि मोतियाबिंद की उपस्थिति में ओसीटी नहीं किया जा सकता है, इन आंखों के उदाहरण के रूप में संबंधित ओसीटी के साथ फंडस छवियों को दिखाता है। चित्रा 6 ए उदाहरण दिखाता है कि संदर्भ के लिए एक फंडस छवि और एक घायल आंख की ओसीटी कैसी दिखती है।
इस मॉडल में आरवीओ की मुख्य आकृति विज्ञान विकृति रेटिना एडिमा है। रेटिना एडिमा के स्तर का आकलन करने के लिए, बेसलाइन रीडिंग के लिए आरवीओ प्रक्रिया के दिन से पहले और रुचि के समय बिंदु पर ओसीटी छवियां लेने की सिफारिश की जाती है। चित्रा 7 घायल आंखों में रेटिना एडिमा के ओसीटी परिमाणीकरण को दर्शाता है। न्यूरोनल परतों की स्थिति निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाने वाला एक और उपाय रेटिना आंतरिक परतों (डीआरआईएल) के विघटन का आकलन करना है। यह नैदानिक सेटिंग में उपयोग किया जाने वाला एक उपाय है जो केशिका नॉनपरफ्यूज़न का प्रतिनिधित्व करता है, आरवीओ 5,9,10 की एक और पहचान है। इस मूल्यांकन का एक उदाहरण चित्रा 7 बी में पाया जा सकता है। चित्रा 7 सी प्रत्येक रेटिना परत के लिए संबंधित लेबल के साथ एक ओसीटी छवि का एक उदाहरण दिखाता है।
चित्र 1: आरवीओ माउस मॉडल की समयरेखा और योजनाबद्ध। (ए) गुलाब बंगाल प्रशासन से लेकर अवरुद्ध नसों की इमेजिंग तक की घटनाओं की समयरेखा। (बी) सफल रेटिना नस फोटोकोग्यूलेशन प्राप्त करने के लिए विधि का संक्षेप में प्रतिनिधित्व। लाल बक्से प्रक्रिया में महत्वपूर्ण चरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं जो अत्यधिक परिवर्तनशील हैं और जिन्हें माउस मॉडल और रुचि के प्रश्न के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है। (सी) रेटिना प्रमुख नसें (वी) धमनियों (ए) की तुलना में व्यापक और गहरे रंग की होती हैं। प्रत्येक प्रमुख नस को ऑप्टिक तंत्रिका से 375 μm की औसत दूरी पर 532 nm, स्पॉट आकार 50 μm, शक्ति 100 mW, अवधि 1 s, कुल ऊर्जा 0.3 J, और चमकदार एक्सपोजर 15278.87 J / cm2 के निर्देशित लेजर के साथ विकिरणित किया जाएगा। (डी) लेजर अनुप्रयोग लगभग 150 μm के फंडस इमेजिंग पर दिखाई देने वाले वाष्पीकरण बुलबुले का कारण बनता है और कुल रेटिना क्षेत्र के <4% को कवर करता है। संख्याएं जहाजों को विकिरणित करते समय लेजर बीम के आंदोलन (तीर) के सुझाए गए स्थान और दिशा का प्रतिनिधित्व करती हैं। संक्षेप: ए = धमनी; वी = नस; ओएन = ऑप्टिक तंत्रिका। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: गुलाब बंगाल प्रशासन के सापेक्ष फोटो-रोड़ा का समय सफल फोटोकॉग्यूलेशन के लिए महत्वपूर्ण है। (A) गुलाब बंगाल प्रशासन के 10 और 20 मिनट बाद iEC Casp9 WT और iEC Casp9 KO फोटो-ऑक्लुडेड की फंडस रेटिना छवियां। सफेद घेरे उन नसों का प्रतिनिधित्व करते हैं जिनमें सफल रोड़ा था। (बी) विकिरण के तुरंत बाद अवरोधों की संख्या (0 घंटे) और संयुक्त जीनोटाइप के 10 मिनट और 20 मिनट के बाद गुलाब बंगाल इंजेक्शन के लिए विकिरण के 1 दिन बाद। वेल्च का टी-टेस्ट, त्रुटि पट्टियाँ एसईएम को इंगित करती हैं। (C) जीनोटाइप द्वारा अलग किए गए अवरोधों की संख्या। दो-तरफा एनोवा और फिशर का एलएसडी परीक्षण; त्रुटि पट्टियाँ SEM को इंगित करती हैं। संक्षिप्तीकरण: WT = जंगली प्रकार; केओ = नॉकआउट; एसईएम = माध्य की मानक त्रुटि; एनोवा = विचरण का विश्लेषण; एलएसडी = कम से कम महत्वपूर्ण अंतर; एनएस = महत्वपूर्ण नहीं; पी-आरवीओ = पोस्ट रेटिना नस रोड़ा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: बेसलाइन और प्रयोगात्मक लेजर आउटपुट को मापना सफल फोटोकॉग्यूलेशन के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं। फोटोकोग्यूलेशन के 10 मिनट बाद आईईसी कैस्प 9 डब्ल्यूटी और आईईसी कैस्प 9 केओ की फंडस रेटिना छवियां; विभिन्न बेसलाइन और प्रयोगात्मक लेजर आउटपुट स्तरों के साथ फोटो-ऑक्लुडेड। कम बेसलाइन लेजर आउटपुट को प्रयोगात्मक लेजर आउटपुट (12.8 मेगावाट, 110 मेगावाट) के साथ मुआवजा दिया जा सकता है। सफेद घेरे उन नसों का प्रतिनिधित्व करते हैं जिनमें सफल रोड़ा था। संक्षिप्तरूप: डब्ल्यूटी = जंगली प्रकार; केओ = नॉकआउट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4: आरवीओ विधि के परिणामस्वरूप विभिन्न प्रकार के अवरोध होते हैं। (A) C57BL/6J, iEC Casp9 WT, और iEC Casp9 KO की फंडस रेटिना छवियां विभिन्न प्रकार के अवरोधों के साथ फोटोकोग्यूलेशन के 10 मिनट बाद: पूरी तरह से अवरुद्ध, आंशिक रूप से अवरुद्ध, आंशिक रूप से पुन: संक्रमित, और पूरी तरह से पुन: उत्पन्न। इनसेट एक नस का एक केंद्रित दृश्य दिखाते हैं जिसके परिणामस्वरूप फोटोकोग्यूलेशन के बाद एक विशिष्ट प्रकार का रोड़ा होता है। (बी) विकिरण के बाद पहले 10 मिनट के दौरान प्रत्येक जीनोटाइप के लिए विभिन्न रोड़ा अवस्थाओं में अवरुद्ध नसों के प्रतिशत का परिमाणीकरण। दस मिनट के वीडियो का मूल्यांकन दो जांचकर्ताओं द्वारा किया गया था, जो जीनोटाइप से अंधे थे, जिन्होंने प्रति अवधि के लिए अलग-अलग रोड़ा राज्यों (पूरी तरह से अवरुद्ध (-2), आंशिक रूप से अवरुद्ध (-1), पूरी तरह से पुन: संक्रमित (2), और आंशिक रूप से पुन: संक्रमित (1)) को संख्याएं सौंपीं। संक्षेप: आरवीओ = रेटिना नस रोड़ा; डब्ल्यूटी = जंगली प्रकार; केओ = नॉकआउट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: आरवीओ के बाद रोड़ा की समयरेखा। लेजर विकिरण के बाद C57BL/6J, iEC Casp9 WT, और iEC Casp9 KO 0, 5 मिनट, 10 मिनट और 24 घंटे की फंडस रेटिना छवियां। पहले 10 मिनट रोड़ा की स्थिति के लिए महत्वपूर्ण हैं और तेजी से बदल सकते हैं। प्रारंभिक 10 मिनट के बाद, रोड़ा कम से कम 24 घंटे तक स्थिर होता है। सफेद वृत्त उन नसों का प्रतिनिधित्व करते हैं जिनमें सफल रोड़ा था, और पीले तीर के निशान लौ के आकार के रक्तस्राव को दर्शाते हैं। संक्षेप: आरवीओ = रेटिना नस रोड़ा; डब्ल्यूटी = जंगली प्रकार; केओ = नॉकआउट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
(ए-ई) फंडस रेटिना छवियों और संबंधित ओसीटी दिखाते हैं। (ए) एक घायल आंख का एक उदाहरण जो आरवीओ प्रक्रिया से नहीं गुजरा था। (बी) सबरेटिनल रक्तस्राव फंडस छवि में वाहिकाओं से रक्त रिसाव को दर्शाता है। (C) फंडस में धुंधली तह और OCT में रेटिना के उठाने से देखा जाने वाला रेटिना डिटेचमेंट। (D) OCT में बड़ी मात्रा में सूजन द्वारा दिखाई गई अत्यधिक एडिमा। (E) पूरी तरह से बिगड़ा हुआ रक्त प्रवाह के साथ एक पूरी तरह से इस्केमिक आंख जिसके परिणामस्वरूप एक सफेद रेटिना होता है। (एफ) मोतियाबिंद आंख के दो अलग-अलग उदाहरण जहां एक स्पष्ट फंडस छवि और ओसीटी प्राप्त नहीं किया जा सकता है। OCT स्केल सलाखों: 100 μm. संक्षेप: आरवीओ = रेटिना नस रोड़ा; ओसीटी = ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 7: ओसीटी छवियों का परिमाणीकरण। (ए) आरवीओ प्रक्रिया से गुजरने वाली अनियंत्रित नियंत्रण आंखों और आंखों में परत की मोटाई और डीआरआईएल की जांच करना। जीसीएल, आईपीएल, आईएनएल, ओपीएल, ओएनएल, बाहरी खंड, और पूरे रेटिना माप। सांख्यिकी, मान-व्हिटनी परीक्षण पी-मान: जीसीएल: 0.0070, आईपीएल: 0.0205, आईएनएल: <0.0001, ओपीएल: 0.0014, ओएनएल: 0.5582, बाहरी खंड: 0.44852, पूरे रेटिना: 0.0019। (बी) डीआरआईएल परिमाणीकरण को बिना लेंस वाले नियंत्रणों और आरवीओ डब्ल्यूटी और केओ आईईसी कैस्प 9 चूहों के साथ-साथ सी 57 / बीएल 6 जे चूहों से ओसीटी छवियों से मापा जाता है, जिनके पास आरवीओ था। त्रुटि पट्टियाँ SEM दिखाती हैं। (C) उदाहरण OCT प्रत्येक रेटिना परत के लेबल के साथ. संक्षेप: डीआरआईएल = आंतरिक रेटिना परतों का विघटन; आरवीओ = रेटिना नस रोड़ा; डब्ल्यूटी = जंगली प्रकार; केओ = नॉकआउट; जीसीएल = गैंग्लियन सेल परत; आईपीएल = इनर प्लेक्सीफॉर्म लेयर; आईएनएल = आंतरिक परमाणु परत; ओपीएल = बाहरी प्लेक्सीफॉर्म परत; ओएनएल = बाहरी परमाणु परत; एसईएम = माध्य की मानक त्रुटि; ओसीटी = ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी; एनएस = महत्वपूर्ण नहीं है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| बेसलाइन लेजर आउटपुट (mW) | अनुशंसित प्रायोगिक लेजर आउटपुट (mW) | अनुशंसित समय एक्सपोजर (एमएस) |
| <11.0 या >15.0 | लेजर को बंद करें और फाइबर को अंत में समायोजित करें जो लेजर नियंत्रण बॉक्स से जुड़ा हुआ है। इसे अनस्क्रू करें और इसे दाईं या बाईं ओर थोड़ा ले जाएं। परिणाम को फिर से मापें, जब तक कि यह उच्च या निम्न मूल्य तक न पहुंच जाए। | |
| 11.0-12.0 | 120 | 1,000 |
| 12.0-13.0 | 110 | 1,000 |
| 13.0-14.0 | 100 | 1,000 |
| 14.0-15.0 | 100 | 1,000 |
तालिका 1: कम बेसलाइन लेजर आउटपुट को उच्च प्रयोगात्मक लेजर आउटपुट के साथ मुआवजा दिया जा सकता है। बेसलाइन लेजर आउटपुट और अनुशंसित प्रयोगात्मक लेजर आउटपुट और एक्सपोज़र समय में भिन्नता।
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Discussion
माउस आरवीओ मॉडल आरवीओ पैथोलॉजी को समझने और संभावित चिकित्सीय का परीक्षण करने के लिए एक एवेन्यू प्रदान करता है। जबकि माउस आरवीओ मॉडल का व्यापक रूप से क्षेत्र में उपयोग किया जाता है, मॉडल के वर्तमान विस्तृत प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है जो इसकी परिवर्तनशीलता को संबोधित करता है और मॉडल के अनुकूलन का वर्णन करता है। यहां, हम अनुभव से उदाहरणों के साथ एक गाइड प्रदान करते हैं कि प्रयोगात्मक जानवरों के एक समूह में सबसे सुसंगत परिणाम प्राप्त करने और विश्वसनीय डेटा प्रदान करने के लिए क्या बदला जा सकता है।
आरवीओ माउस मॉडल के दो सबसे आवश्यक तत्व लेजर आउटपुट और फोटोसेंसिटाइज़र डाई के सफल अंतःशिरा इंजेक्शन हैं। जमावट को प्रेरित करने के लिए आवश्यक शक्ति का उत्पादन करने के लिए जब लेजर का उद्देश्य किसी विशेष नस पर होता है, तो लेजर आउटपुट को ठीक से समायोजित किया जाना चाहिए। हालांकि यह विधि में सुझाई गई तकनीकों का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है, प्रत्येक प्रयोगशाला के सिस्टम सेटअप में अंतर पर विचार करना महत्वपूर्ण है। फाइबर-ऑप्टिक केबल की विविधताएं और उपकरण और कमरे के तापमान के संबंध में इसे कैसे समायोजित किया जाता है, कुछ चर हैं जो कम लेजर आउटपुट के लिए जिम्मेदार हो सकते हैं। लेजर आउटपुट को बढ़ाने के लिए सिस्टम सेटअप के लिए स्वतंत्र ट्यूनिंग की सिफारिश की जाती है।
हालांकि, यह प्रयास फोटोसेंसिटाइज़र डाई देने के लिए उपयुक्त पूंछ नस तकनीक के बिना अक्षम है। टेल नस इंजेक्शन प्राप्त करना मुश्किल हो सकता है, और यह एक कौशल है जिसे विकसित करने में समय लगता है। खराब इंजेक्शन के परिणामस्वरूप कोई अवरोध नहीं हो सकता है; इस मामले में, गुलाब बंगाल को आईपी के माध्यम से प्रशासित किया जा सकता है। आईपी के माध्यम से रोज बंगाल प्रशासन का उपयोग आरवीओ मॉडल करने के लिए किया गया है, लेकिन लंबे लेजर विकिरण समय (3 एस) और उच्च गुलाब बंगाल एकाग्रता (40 मिलीग्राम / एमएल) 11 के साथ। लंबे समय तक लेजर विकिरण को सीमित करने और विशेष रूप से वाहिका को लक्षित करने के लिए, पूंछ की नस प्रशासन का पसंदीदा तरीका है।
इस मॉडल को वाई ईओसिन और सोडियम फ्लोरेसिन12,13,14 जैसे अन्य फोटोएक्टिवेटेबल रंगों का उपयोग करके भी पूरा किया जा सकता है, हालांकि गुलाब बंगाल सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला फोटोएक्टिवेटेबल डाई 4,5,6,8 है। सभी रंगों को नैदानिक रोग की शुरुआती विशेषताओं जैसे रेटिना रक्तस्राव और रेटिना एडिमा15 का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है। फोटोएक्टिवेटेबल रंगों को जानवरों पर कोई प्रतिकूल प्रभाव नहीं दिखाया गया है, इस प्रकार महत्वहीन सिस्टम विषाक्तता15,16 दिखाई देती है। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि चुने गए डाई में उपयोग किए जा रहे लेजर की तरंग दैर्ध्य के साथ अधिकतम संगत अवशोषण होना चाहिए। रोज बंगाल में 525 एनएम17 पर उत्तेजना, 475-490 एनएम18 पर सोडियम फ्लोरेसिन और 490 एनएम19 पर वाई ईओसिन है।
इस मॉडल में परिवर्तनशीलता के मुख्य स्रोत गुलाब बंगाल प्रशासन और बेसलाइन और प्रयोगात्मक लेजर आउटपुट के सापेक्ष फोटो-रोड़ा का समय है। जबकि चित्र 2 फोटो-रोड़ा के लिए 10- और 20-मिनट समय बिंदु दिखाता है, 5- और 15-मिनट के प्रयोगों की एक छोटी संख्या भी की गई थी (डेटा नहीं दिखाया गया है), जिससे अवरोध उत्पन्न होते हैं जो 10 मिनट के समय बिंदु के अनुरूप नहीं थे। इसलिए, इस विधि के लिए गुलाब बंगाल प्रशासन और फोटो-रोड़ा के बीच इष्टतम प्रतीक्षा समय के लिए 10 मिनट को चुना गया था। हालांकि, अध्ययनों से पता चला है कि आरवीओ को गुलाब बंगाल 5 के प्रशासन के बाद 3 मिनट की शुरुआत में भी प्रेरित किया जा सकताहै। गुलाब बंगाल से फोटो-रोड़ा तक माउस स्ट्रेन-विशिष्ट इष्टतम प्रतीक्षा समय निर्धारित करने का एक और तरीका टेट्रामिथाइलरोडामाइन (टीआरआईटीसी) फिल्टर के साथ फ्लोरेसेंस इमेजिंग मोड का उपयोग करके सापेक्ष गुलाब बंगाल एकाग्रता की निगरानी करना है। हालांकि, यहां वर्णित प्रोटोकॉल रेटिना इमेजिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके किया जा सकता है जिसमें टीआरआईटीसी फिल्टर नहीं है।
इस मॉडल में उच्च परिवर्तनशीलता का दूसरा स्रोत बेसलाइन लेजर आउटपुट है। चूंकि बेसलाइन लेजर आउटपुट के दिन-प्रतिदिन के स्तर काफी भिन्न हो सकते हैं, इसलिए प्रत्येक प्रयोग से पहले स्तरों का आकलन करना महत्वपूर्ण है। अध्ययनों में बेसलाइन लेजर आउटपुट को मानकीकृत करने से आरवीओ माउस मॉडल के उपयोग को शक्तिशाली और विस्तारित करने में मदद मिल सकती है। फाइबर केबल को फिर से तैयार करना बेसलाइन स्तरों को संशोधित करने के लिए पर्याप्त हो सकता है; हालांकि, यदि 13.0 mW माप तक नहीं पहुंचा जा सकता है, तो तालिका 1 प्रयोगात्मक शक्ति का उपयोग करके मुआवजे के लिए एक मार्गदर्शिका प्रदान करती है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि क्योंकि रेटिना एक बंद प्रणाली है, इसलिए आरवीओ मॉडल में क्षति की गंभीरता को समझने, नियंत्रित करने और भविष्यवाणी करने के लिए शिराओं के अंश का निर्धारण करना आवश्यक है। क्षतिग्रस्त रीडआउट (डीआरआईएल और रेटिना मोटाई) का पिछला विश्लेषण आरवीओ8 के बाद 8 दिनों में अवरुद्ध नसों के अंश से संबंधित है और रेटिना शोष की भविष्यवाणी करता है। इस प्रकार, अवरुद्ध नसों के अंश पर विचार किया जाना चाहिए और मूल्यांकन किया जाना चाहिए। यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि अन्य मध्यवर्ती रोड़ा अवस्थाएं, जैसे कि आंशिक रूप से पुन: संक्रमित, आंशिक रूप से अवरुद्ध, या नसें जो एक बार 10 मिनट तक अवरुद्ध और पुन: संक्रमित थीं, रेटिना एडिमा और शोष के विकास में कैसे योगदान करती हैं।
इस प्रकार के अवरोधों के साथ आंखों के आगे के अध्ययन से यह जांचने में मदद मिल सकती है कि क्या पर्याप्त क्षति के लिए एक निरंतर रोड़ा आवश्यक है या यदि इस मॉडल में क्षणिक रोड़ा भी महत्वपूर्ण है। पूछे जा रहे प्रयोगात्मक प्रश्न के आधार पर, विभिन्न रोड़ा दर इष्टतम होगी। ज्यादातर मामलों में 40-50% रोड़ा दर आदर्श है, जिसका अर्थ है कि छह नसों वाली आंख में दो या तीन रोड़ा। यह पर्याप्त चोट सुनिश्चित करता है, लेकिन रेटिना बरकरार है और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल और जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए विच्छेदित किया जा सकता है।
इसे निर्धारित करने के लिए, आरवीओ हस्ताक्षर के एक सफल और प्रतिनिधि रोड़ा के पैथोलॉजिकल दृश्य को अलग करना प्रासंगिक है। आरवीओ द्वारा प्रस्तुत प्राकृतिक रोड़ा में लौ के आकार के रक्तस्राव20 (सबरेटिनल रक्तस्राव के साथ भ्रमित नहीं होना चाहिए) शामिल हैं, जिसे चोट के 24 घंटे बाद इस मॉडल में देखा जा सकता है। आरवीओ मॉडल अवांछित रेटिना चोटों (आरवीओ पैथोलॉजी के विशिष्ट नहीं) को भी जन्म दे सकता है जैसे कि चित्रा 6 बी-एफ में दिखाए गए हैं, अगर इसके मापदंडों को सावधानीपूर्वक नियंत्रित नहीं किया जाता है। गुलाब बंगाल और प्रयोगात्मक लेजर शक्ति की एकाग्रता को विनियमित करने के अलावा इनसे बचने के लिए एक दृष्टिकोण लिया जा सकता है, उन वाहिकाओं को विकिरणित करना बंद करना है जिनमें पहले या दूसरे विकिरण के बाद थ्रोम्बस का स्पष्ट गठन होता है।
इस मॉडल को नियोजित करते समय विचार करने और यह तय करने के लिए अन्य कारक किन नसों को अवरुद्ध करना है, माउस तनाव और पोत व्यास हैं। कुछ माउस उपभेद, जैसे कि बीएएलबी / सी, जिसे आमतौर पर अल्बिनो के रूप में जाना जाता है, प्रकाश क्षतिके लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। इसके अतिरिक्त, उनके पास रेटिना विकास संबंधी घाटे हैं जो ऑप्टिक चियासम और दृश्य तीक्ष्णता22,23 पर विघटन में दोष का कारण बनते हैं। आरवीओ अध्ययन के लिए चुने गए माउस तनाव के लिए अघायल नियंत्रणों के बेसल रेटिना और संवहनी अखंडता का पूरी तरह से मूल्यांकन करने की सिफारिश की जाती है। अध्ययनों से पता चला है कि नस की चौड़ाई रेटिना एडिमा और रोग विकृति24 के विकास में हस्तक्षेप कर सकती है। इस प्रकार, आगे परिवर्तनशीलता से बचने के लिए समान वजन के जानवरों का उपयोग किया जाना चाहिए। एक अध्ययन में किन आंखों का उपयोग करना है, इसके बहिष्करण कारक भी प्रयोगात्मक प्रश्न पर निर्भर करेंगे। किसी भी आंख को शामिल करना बुद्धिमानी हो सकती है जिसे एक बार अवरुद्ध किया गया था, भले ही इसे सिग्नलिंग के लिए अनुवर्ती समय बिंदु पर पुन: पेश किया गया हो। हालांकि, अगर स्थिर रोड़ा वांछित है, तो इन आंखों को बाहर रखा जाएगा। चित्रा 6 संभावित बहिष्करण मानदंड या आंखों के उदाहरण दिखाता है जिसका उपयोग पैथोलॉजिकल विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।
यह दिखाने के लिए कि ये लेजर सेटिंग्स नुकसान नहीं पहुंचा रही थीं और देखे गए प्रभाव वास्तव में रोड़ा द्वारा संचालित थे, पिछले अध्ययनोंमें शाम नियंत्रण किया गया था। शाम चूहों को अभी भी गुलाब बंगाल का पूंछ नस इंजेक्शन मिला, लेकिन नस पर विकिरणित होने के बजाय प्रमुख वाहिकाओं के बीच पैरेन्काइमल स्थान में विकिरणित किया गया। यह सुनिश्चित करने में एक महत्वपूर्ण कदम था कि मॉडल ने लेजर के साथ ऊतक को घायल करने के बजाय रोगियों में देखी गई आरवीओ चोटों को दोहराया। ये शम्स कैसपेज़ -9 या -7 या चूहों में देखी गई किसी भी एडिमा का कोई सक्रियण नहीं दिखाते हैं, जिन्होंने जहाजों को सामान्य लेजर विकिरण प्राप्त किया, यह दर्शाता है कि लेजर का कोई प्रतिकूल प्रभाव नहीं था। इन नियंत्रणों का होना आवश्यक है, खासकर यदि उच्च लेजर सेटिंग्स का उपयोग यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाएगा कि मॉडलिंग की जा रही चोट वांछित क्षति8 का सटीक प्रतिनिधित्व है।
आरवीओ माउस मॉडल को रेटिना और मस्तिष्क में हाइपोक्सिक-इस्केमिक चोटों के परिणामस्वरूप होने वाली अन्य बीमारियों का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है जैसे कि मधुमेह रेटिनोपैथी, रेटिनोपैथी ऑफ प्रीमेच्योरिटी और स्ट्रोक। इसके अतिरिक्त, यह एक मॉडल के रूप में काम कर सकता है जिसमें संवहनी चोट के विकास के लिए प्रासंगिक सिग्नलिंग मार्गों का अध्ययन करना और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में न्यूरोडीजेनेरेशन को सुधारने वाले संभावित उपचारों का परीक्षण करना है। इस रिपोर्ट में अनुरूप अनुकूलन माउस आरवीओ मॉडल में परिवर्तनशीलता को सीमित कर सकता है और आरवीओ के पैथोफिज़ियोलॉजी पर प्रकाश डाल सकता है।
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Disclosures
लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen | Rimadyl | NADA #141-199 | keep at 4 °C |
| Corn Oil | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| Fiber Patch Cable | Thor Labs | M14L02 | |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Lasercheck | Coherent | 1098293 | |
| Phenylephrine | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
| Phoneix Micron IV with Meridian, StreamPix, and OCT modules | Phoenix Technology Group | ||
| Proparacaine Hydrochloride | Akorn | NDC: 17478-263-12 | keep at 4 °C |
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-5G | light-sensitive |
| Tropicamide | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
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