Вскрытие и иммуноокрашивание личиночных слюнных желез комаров Anopheles gambiae
Summary
Слюнная железа взрослого комара (SG) необходима для передачи всех переносимых комарами патогенов их человеческим хозяевам, включая вирусы и паразитов. Это видео демонстрирует эффективную изоляцию SGs от личиночных (L4) стадии комаров Anopheles gambiae и подготовку SGs L4 для дальнейшего анализа.
Abstract
Слюнные железы комаров (SGs) являются необходимым органом-шлюзом для передачи патогенов, переносимых насекомыми. Болезнетворные агенты, в том числе вирусы и паразиты Plasmodium, вызывающие малярию, накапливаются в секреторных полостях SG-клеток. Здесь они готовы к передаче своим позвоночным хозяевам во время последующей кровяной трапезы. Поскольку взрослые железы формируются как развитие остатков почек личиночного протока SG, которые сохраняются после раннего гистолиза pupal SG, личиночный SG является идеальной мишенью для вмешательств, ограничивающих передачу заболевания. Понимание развития личиночного SG может помочь лучше понять его морфологию и функциональные адаптации и помочь в оценке новых вмешательств, которые нацелены на этот орган. Этот видеопротокол демонстрирует эффективную технику выделения, фиксации и окрашивания личинок SGs от комаров Anopheles gambiae. Железы, рассеченные из личинок в 25% растворе этанола, фиксируют в смеси метанола и ледниковой уксусной кислоты с последующей холодной промывкой ацетоном. После нескольких полосканий в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) SGs могут быть окрашены широким спектром маркерных красителей и / или антисывороток против SG-экспрессированных белков. Этот метод выделения личинок SG также может быть использован для сбора ткани для анализа гибридизации in situ, других транскриптомных применений и протеомных исследований.
Introduction
Малярия является серьезной угрозой общественному здравоохранению, вызывающей почти 230 миллионов инфекций и, по оценкам, 409 000 смертей в 2019году 1. Большинство смертей происходит в странах Африки к югу от Сахары и вызваны паразитом Plasmodium falciparum, переносчикомнасекомых которого является Anopheles gambiae,предмет этой видеодемонстрации. Хотя цифры указывают на значительное снижение годового уровня смертности с начала века (>300 000 меньше ежегодных смертей), многообещающее снижение показателей заболеваемости, наблюдаемое с 2000 по 2015 год, сокращается, что свидетельствует о необходимости новых подходов к ограничению передачиболезней2. Среди перспективных дополнительных стратегий борьбы и, возможно, ликвидации малярии — нацеливание на потенциал комаров-переносчиков с использованием редактирования генов на основе CRISPR/Cas9 и генногодрайва3,4,5. Действительно, именно борьба с комарами-переносчиками (за счет более широкого использования обработанных инсектицидами надкроватных сеток длительного пользования) оказала наибольшее воздействие на сокращение передачи болезней6.
Самки комаров приобретают гаметоциты Plasmodium от инфицированного человека во время кровяной трапезы. После оплодотворения, созревания, прохождения эпителия средней кишки, расширения популяции и навигации гемокоэли в их облигатных комарах-хозяевах от сотен до десятков тысяч спорозоитов Plasmodium вторгаются в SG комаров и заполняют секреторные полости составляющих секреторных клеток. Оказавшись внутри секреторных полостей, паразиты имеют прямой доступ к слюнному протоку и, таким образом, готовы к передаче новому хозяину позвоночных при следующем приеме пищи в кровь. Поскольку SG имеют решающее значение для передачи вызывающих малярию спорозоитов их человеческим хозяевам, а лабораторные исследования показывают, что SG не являются необходимыми для кровоснабжения, выживания комаров или плодовитости7,8,9,они представляют собой идеальную мишень для мер по блокированию передачи. Взрослые комары SGs формируются как развитие остатков «протоковой почки» в личиночных SGs, которые сохраняются за пределами раннего гистолиза pupal SG10,что делает личиночную SG идеальной мишенью для вмешательств по ограничению передачи заболевания на взрослой стадии.
Характеристика личиночной стадии развития SG может помочь не только лучше понять его морфологию и функциональные адаптации, но также может помочь в оценке новых вмешательств, которые нацелены на этот орган посредством редактирования генов ключевых регуляторов SG. Поскольку все предыдущие исследования архитектуры личиночных слюнных желез предшествовали иммуноокрашиванию и современным методам визуализации10,11,мы разработали протокол выделения и окрашивания слюнных желез различными антителами и клеточными маркерами12. Это видео демонстрирует этот подход к извлечению, фиксации и окрашиванию личинок SGs из личинок Anopheles gambiae L4 для конфокальной визуализации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный в настоящем описании, был адаптирован из протокола рассечения Drosophila SG и протокола рассечения взрослых комаров14,15,16. Однако большинство маркеров не проникали через базальную мембрану (данные не показаны) при использ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Научно-исследовательский институт по борьбе с малярией Университета Джона Хопкинса за доступ к личинкам An. gambiae и их выращивание.
Materials
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P9791 | |
| Na2HPO4 • 2H2O | Millipore Sigma | 71643 | |
| NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
| Acetone | Millipore Sigma | 179124 | |
| Brush with soft bristles | Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set | B08LH63D89 | |
| Cover slips (22 x 50 mm) | VWR | 48393-195 | |
| DAPI (DNA) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Millipore Sigma | EX0276 | |
| Gilson Pipetman P200 Pipette | Gilson | P200 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Jewelers forceps, Dumont No. 5 | Millipore Sigma | F6521 | |
| KCl | Millipore Sigma | 58221 | |
| Methanol | Millipore Sigma | 1414209 | |
| Nail polish | Amazon (Sally Hansen) | B08148YH9M | |
| Nile Red (lipid) | ThermoFisher Scientific | N1142 | |
| Paper towels/wipes | ULINE | S-7128 | |
| Petri plate (to make putty plate) | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
| Pipette Tips | Gilson | Tips E200ST | |
| Plastic Transfer Pipette | Fisher Scientific | S304671 | |
| Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab | Mouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11 | |
| Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit) | ThermoFisher Scientific | A11008 | |
| Silicone resin and curing agent for putty plate | Dow Chemicals – Ximeter Silicone | PMX-200 | |
| Slides, frosted on one end for labelling | VWR 20 X 50 mm | 48393-195 | |
| Wheat Germ Agglutinin | ThermoFisher Scientific | W834 |
References
- World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization Available from: https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660 (2020)
- Feachem, R. G. A., et al. Malaria eradication within a generation: ambitious, achievable, and necessary. Lancet. 394 (10203), 1056-1112 (2019).
- Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11, 5553 (2020).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Rostami, M. N. CRISPR/Cas9 gene drive technology to control transmission of vector-borne parasitic infections. Parasite Immunology. 42 (9), 12762 (2020).
- Bhatt, S., et al. Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017. Elife. 4, 09672 (2015).
- Mellink, J. J., Vanden Bovenkamp, W. Functional aspects of mosquito salivation in blood feeding of Aedes aegypti. Mosquito News. 41 (1), 115 (1981).
- Ribeiro, J. M., Rossignol, P. A., Spielman, A. Role of mosquito saliva in blood vessel location. Journal of Experimental Biology. 108, 1-7 (1984).
- Yamamoto, D. S., Sumitani, M., Kasashima, K., Sezutsu, H., Matsuoka, H. Inhibition of malaria infection in transgenic Anopheline mosquitoes lacking salivary gland cells. PLoS Pathogens. 12 (9), 1005872 (2016).
- Rishikesh, N. Morphology and development of the salivary glands and their chromosomes in the larvae of Anopheles stephensi sensu stricto. Bulletin of the World Health Organization. 20 (1), 47-61 (1959).
- Jensen, D. V., Jones, J. C. The development of the salivary glands in Anopheles albimanus Wiedemann (Diptera, Culicidae). Annals of the Entomological Society of America. 50 (5), 40824 (1957).
- Chiu, M., Trigg, B., Taracena, M., Wells, M. Diverse cellular morphologies during lumen maturation in Anopheles gambiae larval salivary glands. Insect Molecular Biology. 30 (2), 210-230 (2021).
- MR4. Methods in Anopheles research. Center for Disease Control Available from: https://www.beiresources.org/Portals/2/ (2015)
- Wells, M. B., Andrew, D. J. Salivary gland cellular architecture in the Asian malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Parasites & Vectors. 8, 617 (2015).
- Wells, M. B., Villamor, J., Andrew, D. J. Salivary gland maturation and duct formation in the African malaria mosquito Anopheles gambiae. Scientific Reports. 7 (1), 601 (2017).
- Wells, M. B., Andrew, D. J. Anopheles salivary gland architecture shapes plasmodium sporozoite availability for transmission. mBio. 10 (4), 01238 (2019).
- Clements, A. N. . The physiology of mosquitoes. , (1963).
- Imms, A. D. On the larval and pupal stages of Anopheles maculipennis, meigen. Parasitology. 1 (2), 103-133 (1908).
- Favia, G., et al. Bacteria of the genus Asaia stably associate with Anopheles stephensi, an Asian malarial mosquito vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (21), 9047-9051 (2007).
- Neira Oviedo, M., et al. The salivary transcriptome of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) larvae: A microarray-based analysis. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 39 (5-6), 382-394 (2009).
- Linser, P. J., Smith, K. E., Seron, T. J., Neira Oviedo, M. Carbonic anhydrases and anion transport in mosquito midgut pH regulation. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1662-1671 (2009).
- Linser, P. J., et al. Slc4-like anion transporters of the larval mosquito alimentary canal. Journal of Insect Physiology. 58 (4), 551-562 (2012).
