Disección e inmunotinción de glándulas salivales larvales de mosquitos Anopheles gambiae
Summary
La glándula salival del mosquito adulto (SG) es necesaria para la transmisión de todos los patógenos transmitidos por mosquitos a sus huéspedes humanos, incluidos los virus y parásitos. Este video demuestra el aislamiento eficiente de los SG de los mosquitos Anopheles gambiae en etapa larval (L4) y la preparación de los SG L4 para su posterior análisis.
Abstract
Las glándulas salivales de los mosquitos (SG) son un órgano de entrada necesario para la transmisión de patógenos transmitidos por insectos. Los agentes causantes de enfermedades, incluidos los virus y los parásitos Plasmodium que causan la malaria, se acumulan en las cavidades secretoras de las células SG. Aquí, están preparados para la transmisión a sus huéspedes vertebrados durante una comida de sangre posterior. A medida que las glándulas adultas se forman como una elaboración de restos de brotes larvales del conducto SG que persisten más allá de la histólisis temprana del SG pupal, el SG larvario es un objetivo ideal para las intervenciones que limitan la transmisión de la enfermedad. Comprender el desarrollo larvario de SG puede ayudar a desarrollar una mejor comprensión de su morfología y adaptaciones funcionales y ayudar en la evaluación de nuevas intervenciones que se dirigen a este órgano. Este protocolo de video demuestra una técnica eficiente para aislar, fijar y teñir larvales de mosquitos Anopheles gambiae. Las glándulas diseccionadas de larvas en una solución de etanol al 25% se fijan en una mezcla de metanol y ácido acético glacial, seguida de un lavado de acetona en frío. Después de algunos enjuagues en solución salina tamponada con fosfato (PBS), los SG se pueden teñir con una amplia gama de colorantes marcadores y / o antisueros contra las proteínas expresadas en SG. Este método para el aislamiento de LARVAS SG también podría usarse para recolectar tejido para análisis de hibridación in situ, otras aplicaciones transcriptómicas y estudios proteómicos.
Introduction
La malaria es una importante amenaza para la salud pública que causa casi 230 millones de infecciones y un estimado de 409,000 muertes en 20191. La mayoría de las muertes se producen en el África subsahariana y son causadas por el parásito Plasmodium falciparum,cuyo insecto vector es Anopheles gambiae,objeto de esta demostración en vídeo. Aunque las cifras indican una caída significativa en la tasa de mortalidad anual desde el cambio de siglo (>300.000 muertes anuales menos), las disminuciones prometedoras en las tasas de enfermedad observadas de 2000 a 2015 están disminuyendo, lo que sugiere la necesidad de nuevos enfoques para limitar la transmisión de enfermedades2. Entre las estrategias adicionales prometedoras para controlar y posiblemente eliminar la malaria se encuentra apuntar a la capacidad de los mosquitos vectores utilizando la edición de genes basada en CRISPR / Cas9 y el impulsogenético 3,4,5. De hecho, es la focalización del mosquito vector (a través del uso ampliado de mosquiteros tratados con insecticida de larga duración) lo que ha tenido el mayor impacto en la reducción de la transmisión de enfermedades6.
Los mosquitos hembra adquieren gametocitos Plasmodium de un humano infectado durante una comida de sangre. Después de la fertilización, la maduración, el recorrido del epitelio del intestino medio, la expansión de la población y la navegación del hemocoel en sus huéspedes mosquitos obligados, cientos a decenas de miles de esporozoítos de Plasmodium invaden los SG del mosquito y llenan las cavidades secretoras de las células secretoras constituyentes. Una vez dentro de las cavidades secretoras, los parásitos tienen acceso directo al conducto salival y, por lo tanto, están preparados para la transmisión a un nuevo huésped vertebrado en la próxima comida de sangre. Debido a que los SG son críticos para la transmisión de esporozoítos causantes de malaria a sus huéspedes humanos, y los estudios de laboratorio sugieren que los SG no son esenciales para la alimentación de la sangre, la supervivencia de los mosquitos o la fecundidad7,8,9,representan un objetivo ideal para las medidas de bloqueo de la transmisión. Los SG de mosquitos adultos se forman como una elaboración de restos de “brotes de conducto” en los SG larvales que persisten más allá de la histólisis temprana de SG pupal10,lo que hace que el SG larvario sea un objetivo ideal para las intervenciones para limitar la transmisión de enfermedades en etapa adulta.
Caracterizar la etapa larvaria del desarrollo de SG puede ayudar a desarrollar no solo una mejor comprensión de su morfología y adaptaciones funcionales, sino que también puede ayudar a evaluar nuevas intervenciones que se dirijan a este órgano a través de la edición de genes de reguladores clave de SG. Debido a que todos los estudios previos de arquitectura de las glándulas salivales larvales son anteriores a la inmunotinción y a las técnicas modernas de imagen10,11,hemos desarrollado un protocolo para aislar y teñir las glándulas salivales con una variedad de anticuerpos y marcadores celulares12. Este video demuestra este enfoque para la extracción, fijación y tinción de larvas de SG de larvas de larvas de Anopheles gambiae L4 larvas para imágenes confocales.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí fue adaptado de un protocolo de disección de Drosophila SG y un protocolo de disección de mosquitosadultos 14,15,16. Sin embargo, la mayoría de los marcadores no penetraron en la membrana basal (datos no mostrados) cuando se utilizaron los métodos de disección en adultos y tinción de SG. Las adaptaciones del protocolo para adultos incluyeron diseccionar las glándulas en una solución de EtOH al…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer al Instituto de Investigación de la Malaria de Johns Hopkins por el acceso y la cría de larvas de An. gambiae.
Materials
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P9791 | |
| Na2HPO4 • 2H2O | Millipore Sigma | 71643 | |
| NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
| Acetone | Millipore Sigma | 179124 | |
| Brush with soft bristles | Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set | B08LH63D89 | |
| Cover slips (22 x 50 mm) | VWR | 48393-195 | |
| DAPI (DNA) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Millipore Sigma | EX0276 | |
| Gilson Pipetman P200 Pipette | Gilson | P200 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Jewelers forceps, Dumont No. 5 | Millipore Sigma | F6521 | |
| KCl | Millipore Sigma | 58221 | |
| Methanol | Millipore Sigma | 1414209 | |
| Nail polish | Amazon (Sally Hansen) | B08148YH9M | |
| Nile Red (lipid) | ThermoFisher Scientific | N1142 | |
| Paper towels/wipes | ULINE | S-7128 | |
| Petri plate (to make putty plate) | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
| Pipette Tips | Gilson | Tips E200ST | |
| Plastic Transfer Pipette | Fisher Scientific | S304671 | |
| Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab | Mouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11 | |
| Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit) | ThermoFisher Scientific | A11008 | |
| Silicone resin and curing agent for putty plate | Dow Chemicals – Ximeter Silicone | PMX-200 | |
| Slides, frosted on one end for labelling | VWR 20 X 50 mm | 48393-195 | |
| Wheat Germ Agglutinin | ThermoFisher Scientific | W834 |
References
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