Dissekering och immunstainering av larvens salivkörtlar från Anopheles gambiae Myggor
Summary
Den vuxna myggsalivkörteln (SG) krävs för överföring av alla myggburna patogener till sina mänskliga värdar, inklusive virus och parasiter. Denna video visar effektiv isolering av SGs från larv (L4) scenen Anopheles gambiae myggor och beredning av L4 SGs för ytterligare analys.
Abstract
Myggsalivkörtlar (SGs) är ett nödvändigt gatewayorgan för överföring av insektsburna patogener. Sjukdomsframkallande medel, inklusive virus och Plasmodium parasiter som orsakar malaria, ackumuleras i sekretoriska håligheter av SG-celler. Här är de redo för överföring till sina ryggradsdjur värdar under en efterföljande blodmåltid. Som vuxna körtlar bildas som en utarbetande av larval SG trumman knopp rester som kvarstår bortom tidiga pupal SG histolys, larv SG är ett idealiskt mål för interventioner som begränsar sjukdom överföring. Att förstå larv SG utveckling kan bidra till att utveckla en bättre förståelse för dess morfologi och funktionella anpassningar och stöd i bedömningen av nya insatser som riktar sig till detta organ. Detta videoprotokoll visar en effektiv teknik för att isolera, fixa och färga larv SGs från Anopheles gambiae myggor. Körtlar dissekerade från larver i en 25% etanollösning fixeras i en metanol-glacial ättiksyrablandning, följt av en kall acetontvätt. Efter några sköljningar i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) kan SGs färgas med ett brett spektrum av markörfärger och/eller antisera mot SG-uttryckta proteiner. Denna metod för larval SG isolering kan också användas för att samla vävnad för in situ hybridisering analys, andra transkriptomic tillämpningar och proteomic studier.
Introduction
Malaria är ett stort hot mot folkhälsan som orsakar nästan 230 miljoner infektioner och uppskattningsvis 409 000 dödsfall 20191. Majoriteten av dödsfallen är i Afrika söder om Sahara och orsakas av parasiten Plasmodium falciparum, vars insektsvektor är Anopheles gambiae, ämnet för denna videodemonstration. Även om siffrorna indikerar en betydande minskning av den årliga dödssiffran sedan sekelskiftet (> 300 000 färre årliga dödsfall), minskar de lovande minskningarna av antalet sjukdomar som observerats från 2000 till 2015, vilket tyder på behovet av nya metoder för att begränsa sjukdomsöverföringen2. Bland lovande ytterligare strategier för att kontrollera och eventuellt eliminera malaria är att rikta in sig på myggvektorkapacitet med CRISPR / Cas9-baserad genredigering och gendrift3,4,5. Det är faktiskt inriktningen på myggvektorn (genom utökad användning av långvariga insekticidbehandlade sängnät) som har haft störst inverkan på att minska sjukdomsöverföringen6.
Kvinnliga myggor förvärvar Plasmodium gametocyter från en infekterad människa under en blodmåltid. Efter befruktning, mognad, midgut epitel traversal, befolkning expansion och hemocoel navigering i deras obligate mygg värdar, hundratals till tiotusentals Plasmodium sporozoites invadera mygga SGs och fylla de sekretoriska håligheterna i de ingående sekretoriska cellerna. Väl inne i de sekretoriska håligheterna har parasiterna direkt tillgång till salivkanalen och är därmed redo för överföring till en ny ryggradsdjursvärd vid nästa blodmåltid. Eftersom SGs är avgörande för överföring av malariaframkallande sporozoiter till sina mänskliga värdar, och laboratoriestudier tyder på att SGs inte är nödvändiga för blodmatning, myggöverlevnad eller fecundity7,8,9, representerar de ett idealiskt mål för överföringsblockeringsåtgärder. Vuxna myggA SGs bildas som en utarbetande av “kanalknopp” rester i larv SGs som kvarstår bortom tidig pupal SG histolysis10, vilket gör larven SG ett idealiskt mål för interventioner för att begränsa överföring av sjukdomar i vuxenstadiet.
Att karakterisera larvstadiet av SG-utveckling kan bidra till att utveckla inte bara en bättre förståelse för dess morfologi och funktionella anpassningar utan kan också hjälpa till att bedöma nya interventioner som riktar sig mot detta organ genom genredigering av viktiga SG-regulatorer. Eftersom alla tidigare studier av larv salivary gland arkitektur predate immunostaining och moderna avbildningstekniker10,11, har vi utvecklat ett protokoll för att isolera och färga salivkörtlar med en mängd olika antikroppar och cellmarkörer12. Denna video visar detta tillvägagångssätt för extraktion, fixering och färgning av larval SGs från Anopheles gambiae L4 larver för confocal imaging.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som beskrivs häri anpassades från ett Drosophila SG dissekeringsprotokoll och ett vuxen myggdissektionsprotokoll14,15,16. De flesta markörer trängde dock inte in i källarmembranet (data visas inte) när man använde vuxen dissekering och SG färgningsmetoder. Anpassningar av vuxenprotokollet inkluderade dissekering av körtlarna i en 25% EtOH-lösning, tvättning av körtlarna med en kombination av MeOH och glac…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Johns Hopkins Malaria Research Institute för tillgång till och uppfödning av an. gambiae larver.
Materials
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P9791 | |
| Na2HPO4 • 2H2O | Millipore Sigma | 71643 | |
| NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
| Acetone | Millipore Sigma | 179124 | |
| Brush with soft bristles | Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set | B08LH63D89 | |
| Cover slips (22 x 50 mm) | VWR | 48393-195 | |
| DAPI (DNA) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Millipore Sigma | EX0276 | |
| Gilson Pipetman P200 Pipette | Gilson | P200 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Jewelers forceps, Dumont No. 5 | Millipore Sigma | F6521 | |
| KCl | Millipore Sigma | 58221 | |
| Methanol | Millipore Sigma | 1414209 | |
| Nail polish | Amazon (Sally Hansen) | B08148YH9M | |
| Nile Red (lipid) | ThermoFisher Scientific | N1142 | |
| Paper towels/wipes | ULINE | S-7128 | |
| Petri plate (to make putty plate) | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
| Pipette Tips | Gilson | Tips E200ST | |
| Plastic Transfer Pipette | Fisher Scientific | S304671 | |
| Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab | Mouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11 | |
| Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit) | ThermoFisher Scientific | A11008 | |
| Silicone resin and curing agent for putty plate | Dow Chemicals – Ximeter Silicone | PMX-200 | |
| Slides, frosted on one end for labelling | VWR 20 X 50 mm | 48393-195 | |
| Wheat Germ Agglutinin | ThermoFisher Scientific | W834 |
References
- World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization Available from: https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660 (2020)
- Feachem, R. G. A., et al. Malaria eradication within a generation: ambitious, achievable, and necessary. Lancet. 394 (10203), 1056-1112 (2019).
- Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11, 5553 (2020).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Rostami, M. N. CRISPR/Cas9 gene drive technology to control transmission of vector-borne parasitic infections. Parasite Immunology. 42 (9), 12762 (2020).
- Bhatt, S., et al. Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017. Elife. 4, 09672 (2015).
- Mellink, J. J., Vanden Bovenkamp, W. Functional aspects of mosquito salivation in blood feeding of Aedes aegypti. Mosquito News. 41 (1), 115 (1981).
- Ribeiro, J. M., Rossignol, P. A., Spielman, A. Role of mosquito saliva in blood vessel location. Journal of Experimental Biology. 108, 1-7 (1984).
- Yamamoto, D. S., Sumitani, M., Kasashima, K., Sezutsu, H., Matsuoka, H. Inhibition of malaria infection in transgenic Anopheline mosquitoes lacking salivary gland cells. PLoS Pathogens. 12 (9), 1005872 (2016).
- Rishikesh, N. Morphology and development of the salivary glands and their chromosomes in the larvae of Anopheles stephensi sensu stricto. Bulletin of the World Health Organization. 20 (1), 47-61 (1959).
- Jensen, D. V., Jones, J. C. The development of the salivary glands in Anopheles albimanus Wiedemann (Diptera, Culicidae). Annals of the Entomological Society of America. 50 (5), 40824 (1957).
- Chiu, M., Trigg, B., Taracena, M., Wells, M. Diverse cellular morphologies during lumen maturation in Anopheles gambiae larval salivary glands. Insect Molecular Biology. 30 (2), 210-230 (2021).
- MR4. Methods in Anopheles research. Center for Disease Control Available from: https://www.beiresources.org/Portals/2/ (2015)
- Wells, M. B., Andrew, D. J. Salivary gland cellular architecture in the Asian malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Parasites & Vectors. 8, 617 (2015).
- Wells, M. B., Villamor, J., Andrew, D. J. Salivary gland maturation and duct formation in the African malaria mosquito Anopheles gambiae. Scientific Reports. 7 (1), 601 (2017).
- Wells, M. B., Andrew, D. J. Anopheles salivary gland architecture shapes plasmodium sporozoite availability for transmission. mBio. 10 (4), 01238 (2019).
- Clements, A. N. . The physiology of mosquitoes. , (1963).
- Imms, A. D. On the larval and pupal stages of Anopheles maculipennis, meigen. Parasitology. 1 (2), 103-133 (1908).
- Favia, G., et al. Bacteria of the genus Asaia stably associate with Anopheles stephensi, an Asian malarial mosquito vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (21), 9047-9051 (2007).
- Neira Oviedo, M., et al. The salivary transcriptome of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) larvae: A microarray-based analysis. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 39 (5-6), 382-394 (2009).
- Linser, P. J., Smith, K. E., Seron, T. J., Neira Oviedo, M. Carbonic anhydrases and anion transport in mosquito midgut pH regulation. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1662-1671 (2009).
- Linser, P. J., et al. Slc4-like anion transporters of the larval mosquito alimentary canal. Journal of Insect Physiology. 58 (4), 551-562 (2012).
