Evaluering af leverglukoseproduktion i en polycystisk ovarie syndrom musemodel

Summary

Denne undersøgelse beskriver den direkte måling af leverglukoseproduktion i en polycystisk ovarie syndrom musemodel ved hjælp af en stabil isotop glukose tracer via hale vene i både faste og glukose-rige stater i tandem.

Abstract

Polycystisk ovarie syndrom (PCOS) er en almindelig sygdom, der resulterer i lidelser i glukosemetabolismen, såsom insulinresistens og glukoseintolerance. Dysreguleret glukosemetabolisme er en vigtig manifestation af sygdommen og er nøglen til dens patogenese. Derfor er undersøgelser, der involverer evaluering af glukosemetabolisme i PCOS, af allerstørste betydning. Meget få undersøgelser har kvantificeret hepatisk glukoseproduktion direkte i PCOS-modeller ved hjælp af ikke-radioaktive glukosesporere. I denne undersøgelse diskuterer vi trinvise instruktioner til kvantificering af satsen for hepatisk glukoseproduktion i en PCOS-musemodel ved at måle M+2-berigelse af [6,6-2H2]glukose, en stabil isotopisk glukose tracer, via gaskromatografi – massespektrometri (GCMS). Denne procedure indebærer oprettelse af stabil isotop glukose tracer opløsning, brug af hale venekateter placering og infusion af glukose tracer i både faste og glukose-rige stater i samme mus i tandem. Berigelsen af [6,6-2H2]glukose måles ved hjælp af pentaacetatderivater i GCMS. Denne teknik kan anvendes på en lang række undersøgelser, der involverer direkte måling af hastigheden af leverglukoseproduktion.

Introduction

Polycystisk ovarie syndrom (PCOS) er en almindelig lidelse forekommer hos 12%-20% af reproduktive alderen ^kvinder1,2. Det er en kompleks sygdom, der resulterer i variable fænotyper, der involverer polycystiske æggestokke, uregelmæssig menstruation og klinisk eller laboratoriebevis for hyperandrogenemi, og er typisk diagnosticeret, når en kvinde opfylder to af de tre ^kriterier3. Et fremherskende aspekt af PCOS, og en nøglefaktor i sin patogenese, er metaboliske sindsforvirring, der findes hos kvinder, der har sygdommen. Kvinder med PCOS har højere forekomster af insulinresistens, glukoseintolerance, fedme og metabolisk syndrom3,4,5,6. Insulinresistens er ikke kun en manifestation af sygdommen, men det menes at bidrage til sin patogenese ved at forstærke virkningen af luteiniserende hormon i æggestokken og derved føre til øget androgen ^{produktion7,8}. Insulinresistens menes at have flere mulige oprindelser, men undersøgelser tyder på, at det kan skyldes unormale mønstre af insulinreceptor ^{signalering9,10}. Undersøgelser har evalueret insulinresistens hos PCOS-patienter ved hjælp af guldstandardteknikken hyperinsulinæmisk-euglykæmisk klemme11,12,13,14,15. Kvinder med PCOS, uanset BMI, har højere niveauer af insulinresistens sammenlignet med kontrol. Insulinkontrol over glukoseproduktionen er nedsat i lidelser af insulinresistens, der fører til overskydende glukoseproduktion. For eksempel har diabetikere øget glukoneogenese og nedsat undertrykkelse af glykogenolyse16. Desuden er nedsat undertrykkelse af glukoseproduktionen blevet observeret hos diabetiske ^rotter17. Selvom klemmeundersøgelser kan give en måling af insulinresistens, fokuserer få undersøgelser i PCOS på direkte måling af glukoseproduktion i faste- og fodrede tilstande. Dette kræver brug af en ikke-radioaktiv isotopisk glukose tracer infusion og måling via massespektrometri.

Dyremodeller er blevet flittigt anvendt i PCOS-forskning. Både lean og fede-type PCOS murine modeller er blevet skabt ved at administrere androgener prænatally, prepubertally, eller post-puberteten18. Gnaver PCOS-modeller viser også metaboliske forskelle sammenlignet med deres respektive kontroller. Tidligere data fra vores laboratorium viste unormale glukosetolerancetest (GTT) i PCOS-musemodeller (lean og fede), i overensstemmelse med human ^{PCOS-litteratur19}. Brug af en slank og overvægtig dyremodel giver mulighed for yderligere undersøgelse af metaboliske forskelle. Specifikt tillader denne model evaluering af glukoseproduktionen direkte ved hjælp af isotopiske glukosesporere. En af de mest almindeligt anvendte stabile isotopiske glukose tracer er [6,6-2H2]glukose. Glukoseberigelsen [6,6-2H2] kan måles ved hjælp af et pentaacetatderivater som tidligere ^beskrevet20.

I denne undersøgelse var vores mål at måle hastigheden af leverglukoseproduktion i faste- og glukoserig tilstand hos PCOS-mus ved hjælp af isotopisk glukoseinfusion. Disse teknikker kan anvendes på en lang række eksperimenter, der involverer glukose kinetiker.

Protocol

Alle dyreprocedurer blev godkendt af den institutionelle dyrepleje- og anvendelseskomité (IACUC) fra Baylor College of Medicine. 1. Tilberedning af [6,6-2H2]glukose En dag før proceduren forberedes det stabile isotop glukosesporer i normal saltvand. Til dette eksperiment blev [6,6-2H2]glukose brugt som sporstof til at måle plasmaglukoseudseendeligheden.BEMÆRK: I dette eksperiment blev glukoseproduktionen under faste…

Representative Results

Ved hjælp af tidligere beskrevne isotopfortyndingsligninger blev den samlede plasmaglukoserate (glucoseRa) beregnet ud fra M+2-berigelse af [6,6-2H2]glukose under faste- og glukoserige forhold ved hjælp af pentaacetatderivater21. Under steady-state betingelser antages det, at glukosehastigheden er lig med glukosehastigheden. I kontrolgruppen var den samlede glukoseregne 19,98 ± 2,53 mg/(kg·min) efter 6 timers faste og 25,80 ± 1,76 mg/(kg·min) under…

Discussion

Hyperglykæmi og unormal glukose metabolisme / homøostase er funktioner i PCOS. Blodsukkerniveauet opretholdes ved en kombination af glukose fra kost- og glukoseproduktion via glykogenolyse og glukoneogenese og glykogene under kontrol af hormon og enzymer. Leverglukoseproduktion undertrykkes af tilstedeværelsen af øgede cirkulerende glukoseniveauer. I lidelser af unormal glukose metabolisme, regulering af undertrykkelsen af glukoseproduktionen er kompromitteret fører til hyperglykæmi. Mens mange undersøgel…

Materials

0.9% sodium chloride solution	McKesson	275595
10 mL BD Luer-Lok tip syringe	VWR	75846-756	Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution)
1-inch clear transpore tape	3M	70200400169
1-inch Labeling tape	Fisher	GS07F161BA	Brand is example
5 mL syringe containing heparanized saline flush	McKesson	191-MIH-2235	One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride)
5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets	Fisher Scientific	NC9891620	5 mm if animal is between 2 and 6 months
Acetone	Sigma-Aldrich	650501
Advanced hot plate stirrer	VWR	97042-602	Brand is example
BD 27 gauge 0.5 inch needles	Health Warehouse	A283952
BD 30 gauge 0.5 inch needles	Medvet	305106
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm	VWR	63019-004
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm	VWR	63019-004
Beaker, 1000 mL			Any brand
Caging pellets
Clear VOA glass vials with closed-top cap	Fisher Scientific	05-719-120	For storage of acetone and blood draw samples
Copper toothless alligator clamp for tourniquet	Amazon		Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper
D-(+)-glucose >99.5%	Sigma-Aldrich	G8270
D-glucose (6,6-D2, 99%)	Cambridge Isotope Laboratories, Inc.	DLM-349-PK
Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD	VWR	62999-042
Magnifying glass	Amazon		Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand
Microbalance	Ohaus Adventurer Pro	AV264C	Any similar model with 0.0001g accuracy can be used
Nalgene bottle, 500 mL	Sigma-Aldrich	B0158-12EA	Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom
PHD Ultra multi-syringe pump	Harvard Apparatus	70-3024A
Plexiglass sheet			Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion
Plexiglass sheets and dividers			Any brand; used to cage mice during infusion