多嚢胞性卵巣症候群マウスモデルにおける肝グルコース産生の評価
Summary
本研究では、多嚢胞性卵巣症候群マウスモデルにおける肝グルコース産生の直接測定を、タンデムにおける空腹時およびグルコースが豊富な状態の両方で尾静脈 を介して 安定同位体グルコーストレーサーを用いて説明する。
Abstract
多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)は、インスリン抵抗性およびグルコース不耐症などのグルコース代謝の障害をもたらす一般的な疾患である。調節不秩序なグルコース代謝は、疾患の重要な現れであり、その病因の鍵です。したがって、PCOSにおけるグルコース代謝の評価に関する研究が最も重要である。非常に少数の研究は、非放射性グルコーストレーサーを使用してPCOSモデルで直接肝グルコース産生を定量化している。本研究では、安定同位体グルコーストレーサーである[6,6-2H2]グルコースのM+2濃縮をガスクロマトグラフィー-質量分析(GCMS)を介して測定することにより、PCOSマウスモデルにおける肝グルコース産生速度の定量化に関するステップバイステップの説明を検討する。この手順は、安定な同位体グルコーストレーサー溶液の作成、尾静脈カテーテル配置の使用および同じマウスの同じマウスにおけるグルコーストレーサーの注入を伴う。グルコースの濃縮は、GCMSでペンタセテート誘導体を用いて測定される。この技術は、肝グルコース産生速度の直接測定を含む多種多様な研究に適用することができる。
Introduction
多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)は、生殖年齢の女性の12%〜20%で起こる一般的な障害である1,2。これは、多嚢胞性卵巣、不規則な月経および高アンドロゲン血症の臨床または実験室の証拠を含む可変的な形型をもたらす複雑な疾患であり、典型的には、女性が3つの基準のうちの2つを満たすと診断される3。PCOSの主な側面とその病因の重要な要因は、病気を持つ女性に見られる代謝変性です。PCOSを有する女性は、インスリン抵抗性、耐糖不耐症、肥満、およびメタボリックシンドロームの発生率が高い3,4,5,6。インスリン抵抗性は、疾患の現れであるだけでなく、卵巣における黄体形成ホルモンの作用を増強することによってその病態に寄与すると考えられ、それによってアンドロゲン産生の増加に繋がる7,8。インスリン抵抗性はいくつかの可能な起源を有すると考えられているが、研究は、それがインスリン受容体シグナル伝達の異常なパターンに起因する可能性を示唆しています 9,10.研究は、高インスリン法順性クランプ11、12、13、14、15の金標準技術を用いてPCOS患者におけるインスリン抵抗性を評価した。PCOSを持つ女性は、BMIに関係なく、コントロールと比較してインスリン抵抗性のレベルが高い。ブドウ糖産生に対するインスリン制御は、過剰なグルコース産生をもたらすインスリン抵抗性の障害において障害される。例えば、糖尿病患者は糖新生の割合を増加させ、グリコーゲン分解16の抑制を損なった。さらに、糖尿病ラット17ではグルコース産生の抑制障害が認められている。クランプ研究はインスリン抵抗性の測定を与えることができますが、PCOSでは断食状態と供給状態でのグルコース産生の直接測定に焦点を当てた研究はほとんどありません。これには、非放射性同位体グルコーストレーサーの注入と質量分析による測定の使用が必要です。
動物モデルは、PCOSの研究で広く使用されています。無駄のないおよび肥満タイプPCOSの両方のマウスモデルは、アンドロゲンを出生前、前立て、または後pubertally18に投与することによって作成された。げっ歯類PCOSモデルはまた、それぞれのコントロールと比較して代謝の違いを示しています。私たちの研究室からの以前のデータは、PCOSマウスモデル(リーンおよび肥満)における異常なグルコース耐性試験(GTT)を実証し、ヒトPCOS文献19と一致しました。無駄のない肥満の動物モデルの使用は、代謝の違いのさらなる調査を可能にする。具体的には、同位体グルコーストレーサーを用いてグルコース産生率を直接評価することができる。最も一般的に使用される安定同位体グルコーストレーサーの1つは[6,6-2H2]グルコースである。[6,6-2H2]グルコース濃縮は、先述したペンタセテート誘導体20を用いて測定することができる。
本研究では、同位体グルコース注入を用いたPCOSマウスにおける空腹時及びグルコースが豊富な状態における肝グルコース産生率を測定することを目的とした。これらの技術は、グルコース動態を含む幅広い実験に適用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
高血糖と異常なグルコース代謝/恒常性はPCOSの特徴です。血糖値は、ホルモンと酵素の制御下で、グリコーゲン分解および糖新生および糖生成を介した食事とグルコース産生からのグルコースの組み合わせによって維持される。肝グルコース産生は、循環グルコースレベルの上昇の存在によって抑制される。異常なグルコース代謝の障害では、高血糖をもたらすグルコース産生の抑制?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所のCSB、SC、JMに対する産婦人科、ベイラー医科大学(ALG)、R-01研究助成金(グラント#DK114689)のトレーニング助成金によって支えられました。
Materials
| 0.9% sodium chloride solution | McKesson | 275595 | |
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringe | VWR | 75846-756 | Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution) |
| 1-inch clear transpore tape | 3M | 70200400169 | |
| 1-inch Labeling tape | Fisher | GS07F161BA | Brand is example |
| 5 mL syringe containing heparanized saline flush | McKesson | 191-MIH-2235 | One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride) |
| 5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets | Fisher Scientific | NC9891620 | 5 mm if animal is between 2 and 6 months |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | |
| Advanced hot plate stirrer | VWR | 97042-602 | Brand is example |
| BD 27 gauge 0.5 inch needles | Health Warehouse | A283952 | |
| BD 30 gauge 0.5 inch needles | Medvet | 305106 | |
| BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm | VWR | 63019-004 | |
| BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm | VWR | 63019-004 | |
| Beaker, 1000 mL | Any brand | ||
| Caging pellets | |||
| Clear VOA glass vials with closed-top cap | Fisher Scientific | 05-719-120 | For storage of acetone and blood draw samples |
| Copper toothless alligator clamp for tourniquet | Amazon | Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper | |
| D-(+)-glucose >99.5% | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-glucose (6,6-D2, 99%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-349-PK | |
| Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD | VWR | 62999-042 | |
| Magnifying glass | Amazon | Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand | |
| Microbalance | Ohaus Adventurer Pro | AV264C | Any similar model with 0.0001g accuracy can be used |
| Nalgene bottle, 500 mL | Sigma-Aldrich | B0158-12EA | Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom |
| PHD Ultra multi-syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3024A | |
| Plexiglass sheet | Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion | ||
| Plexiglass sheets and dividers | Any brand; used to cage mice during infusion |
References
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