Evaluación de la producción hepática de glucosa en un modelo de ratón con síndrome de ovario poliquístico

Summary

Este estudio describe la medición directa de la producción hepática de glucosa en un modelo de ratón con síndrome de ovario poliquístico mediante el uso de un trazador de glucosa isotópico estable a través de la vena de la cola en estados de ayuno y ricos en glucosa en tándem.

Abstract

El síndrome de ovario poliquístico (SOP) es una enfermedad común que produce trastornos del metabolismo de la glucosa, como la resistencia a la insulina y la intolerancia a la glucosa. El metabolismo desregulado de la glucosa es una manifestación importante de la enfermedad y es la clave de su patogénesis. Por lo tanto, los estudios que involucran la evaluación del metabolismo de la glucosa en el SOP son de suma importancia. Muy pocos estudios han cuantificado la producción hepática de glucosa directamente en modelos de SOP utilizando trazadores de glucosa no radiactivos. En este estudio, discutimos las instrucciones paso a paso para la cuantificación de la tasa de producción de glucosa hepática en un modelo de ratón con SOP midiendo el enriquecimiento M+2 de [6,6-2H2]glucosa, un trazador de glucosa isotópico estable, mediante cromatografía de gases – espectrometría de masas (GCMS). Este procedimiento implica la creación de una solución trazadora de glucosa isotópica estable, el uso de la colocación del catéter de la vena de la cola y la infusión del marcador de glucosa en estados de ayuno y ricos en glucosa en el mismo ratón en tándem. El enriquecimiento de [6,6-2H2]glucosa se mide utilizando el derivado del pentaacetato en GCMS. Esta técnica se puede aplicar a una amplia variedad de estudios que implican la medición directa de la tasa de producción hepática de glucosa.

Introduction

El síndrome de ovario poliquístico (SOP) es un trastorno frecuente que ocurre en el 12%-20% de las mujeres en edad ^{reproductiva1,2}. Es una enfermedad compleja que da lugar a fenotipos variables que involucran ovarios poliquísticos, menstruaciones irregulares y evidencia clínica o de laboratorio de hiperandrogenemia, y generalmente se diagnostica cuando una mujer cumple con dos de los tres ^criterios3. Un aspecto predominante del SOP, y un factor clave en su patogénesis, son los trastornos metabólicos que se encuentran en las mujeres que tienen la enfermedad. Las mujeres con SOP tienen una mayor incidencia de resistencia a la insulina, intolerancia a la glucosa, obesidad y síndrome metabólico3,4,5,6. La resistencia a la insulina no es solo una manifestación de la enfermedad, sino que se cree que contribuye a su patogénesis al potenciar la acción de la hormona luteinizante en el ovario, lo que lleva a un aumento de la producción de andrógenos7,8. Se cree que la resistencia a la insulina tiene varios orígenes posibles, pero los estudios sugieren que puede deberse a patrones anormales de señalización del receptor de ^insulina9,10. Los estudios han evaluado la resistencia a la insulina en pacientes con SOP utilizando la técnica estándar de oro de la pinza hiperinsulinémica-euglucémica11,12,13,14,15. Las mujeres con SOP, independientemente del IMC, tienen niveles más altos de resistencia a la insulina en comparación con los controles. El control de la insulina sobre la producción de glucosa se ve afectado en los trastornos de resistencia a la insulina que conducen a un exceso de producción de glucosa. Por ejemplo, los pacientes diabéticos tienen mayores tasas de gluconeogénesis y alteración de la supresión de la glucogenólisis16. Además, se ha observado una alteración de la supresión de la producción de glucosa en ratas ^{diabéticas17}. Aunque los estudios de pinzas pueden dar una medición de la resistencia a la insulina, pocos estudios en SOP se centran en la medición directa de la producción de glucosa en estados de ayuno y alimentación. Esto requiere el uso de una infusión de trazador de glucosa isotópica no radiactiva y la medición a través de espectrometría de masas.

Los modelos animales se han utilizado ampliamente en la investigación del SOP. Tanto los modelos murinos de SOP magro como los obesos se han creado mediante la administración de andrógenos prenatal, prepuberal o ^{postpuberal18}. Los modelos de SOP en roedores también demuestran diferencias metabólicas en comparación con sus respectivos controles. Datos previos de nuestro laboratorio demostraron pruebas de tolerancia anormal a la glucosa (GTT) en modelos de ratón con SOP (delgados y obesos), consistentes con la literatura humana de ^SOP19. El uso de un modelo animal delgado y obeso permite una mayor investigación sobre las diferencias metabólicas. Específicamente, este modelo permite evaluar la tasa de producción de glucosa directamente utilizando trazadores de glucosa isotópicos. Uno de los trazadores de glucosa isotópica estable más utilizados es [6,6-2H2]glucosa. El enriquecimiento de [6,6-2H2]glucosa se puede medir utilizando un derivado de pentaacetato como se describió ^{anteriormente20}.

En este estudio, nuestro objetivo fue medir la tasa de producción hepática de glucosa en ayunas y en estado rico en glucosa en ratones con SOP utilizando infusión de glucosa isotópica. Estas técnicas se pueden aplicar a una amplia gama de experimentos que involucran la cinética de la glucosa.

Protocol

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Baylor College of Medicine. 1. Preparación de [6,6-2H2]glucosa Un día antes del procedimiento, prepare el marcador de glucosa de isótopos estables en solución salina normal. Para este experimento, se utilizó [6,6-2H2]glucosa como marcador para medir la tasa de aparición de glucosa en plasma….

Representative Results

Utilizando ecuaciones de dilución de isótopos previamente descritas, la tasa total de glucosa plasmática (glucoseRa) se calculó a partir del enriquecimiento M+2 de [6,6-2H2]glucosa en condiciones de ayuno y ricas en glucosa utilizando el derivado pentaacetato21. En condiciones de estado estacionario, se supone que la tasa de aparición de glucosa es igual a la tasa de desaparición de glucosa. En el grupo control, la glucosaRa total fue de 19,98 ± 2…

Discussion

La hiperglucemia y el metabolismo/homeostasis anormal de la glucosa son características del SOP. El nivel de glucosa en sangre se mantiene mediante una combinación de glucosa de la dieta y la producción de glucosa a través de la glucogenólisis y la gluconeogénesis y la glucogénesis, bajo el control de la hormona y las enzimas. La producción hepática de glucosa se suprime por la presencia de un aumento de los niveles de glucosa circulante. En los trastornos del metabolismo anormal de la glucosa, la regul…

Materials

0.9% sodium chloride solution	McKesson	275595
10 mL BD Luer-Lok tip syringe	VWR	75846-756	Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution)
1-inch clear transpore tape	3M	70200400169
1-inch Labeling tape	Fisher	GS07F161BA	Brand is example
5 mL syringe containing heparanized saline flush	McKesson	191-MIH-2235	One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride)
5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets	Fisher Scientific	NC9891620	5 mm if animal is between 2 and 6 months
Acetone	Sigma-Aldrich	650501
Advanced hot plate stirrer	VWR	97042-602	Brand is example
BD 27 gauge 0.5 inch needles	Health Warehouse	A283952
BD 30 gauge 0.5 inch needles	Medvet	305106
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm	VWR	63019-004
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm	VWR	63019-004
Beaker, 1000 mL			Any brand
Caging pellets
Clear VOA glass vials with closed-top cap	Fisher Scientific	05-719-120	For storage of acetone and blood draw samples
Copper toothless alligator clamp for tourniquet	Amazon		Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper
D-(+)-glucose >99.5%	Sigma-Aldrich	G8270
D-glucose (6,6-D2, 99%)	Cambridge Isotope Laboratories, Inc.	DLM-349-PK
Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD	VWR	62999-042
Magnifying glass	Amazon		Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand
Microbalance	Ohaus Adventurer Pro	AV264C	Any similar model with 0.0001g accuracy can be used
Nalgene bottle, 500 mL	Sigma-Aldrich	B0158-12EA	Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom
PHD Ultra multi-syringe pump	Harvard Apparatus	70-3024A
Plexiglass sheet			Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion
Plexiglass sheets and dividers			Any brand; used to cage mice during infusion