Evaluierung der hepatischen Glukoseproduktion in einem Mausmodell mit polyzystischem Ovarialsyndrom

Summary

Diese Studie beschreibt die direkte Messung der hepatischen Glukoseproduktion in einem Mausmodell mit polyzystischem Ovarialsyndrom unter Verwendung eines stabilen Isotopenglukose-Tracers über die Schwanzvene sowohl im nüchternen als auch im glukosereichen Zustand im Tandem.

Abstract

Das polyzystische Ovarialsyndrom (PCOS) ist eine häufige Erkrankung, die zu Störungen des Glukosestoffwechsels wie Insulinresistenz und Glukoseintoleranz führt. Der fehlregulierte Glukosestoffwechsel ist eine wichtige Manifestation der Krankheit und der Schlüssel zu ihrer Pathogenese. Daher sind Studien zur Bewertung des Glukosestoffwechsels bei PCOS von größter Bedeutung. Nur sehr wenige Studien haben die hepatische Glukoseproduktion direkt in PCOS-Modellen mit nicht-radioaktiven Glukose-Tracern quantifiziert. In dieser Studie diskutieren wir Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Quantifizierung der Rate der hepatischen Glukoseproduktion in einem PCOS-Mausmodell durch Messung der M+2-Anreicherung von [6,6-2H2]Glucose, einem stabilen Isotopenglukose-Tracer, mittels Gaschromatographie – Massenspektrometrie (GCMS). Dieses Verfahren beinhaltet die Herstellung einer stabilen isotopenförmigen Glucose-Tracer-Lösung, die Verwendung der Platzierung des Schwanzvenenkatheters und die Infusion des Glucose-Tracers sowohl im nüchternen als auch im glucosereichen Zustand in derselben Maus im Tandem. Die Anreicherung von [6,6-2H2]Glucose wird mit Pentaacetatderivat in GCMS gemessen. Diese Technik kann auf eine Vielzahl von Studien angewendet werden, die eine direkte Messung der Rate der hepatischen Glukoseproduktion beinhalten.

Introduction

Das polyzystische Ovarialsyndrom (PCOS) ist eine häufige Erkrankung, die bei 12 %-20 % der Frauen im gebärfähigen Alter ^auftritt1,2. Es ist eine komplexe Erkrankung, die zu variablen Phänotypen führt, an denen polyzystische Eierstöcke, unregelmäßige Menstruationen und klinische oder Labornachweise einer Hyperandrogenämie beteiligt sind, und wird typischerweise diagnostiziert, wenn eine Frau zwei der drei Kriterien ^erfüllt3. Ein vorherrschender Aspekt von PCOS und ein Schlüsselfaktor für seine Pathogenese sind metabolische Störungen, die bei Frauen mit der Krankheit auftreten. Frauen mit PCOS haben eine höhere Inzidenz von Insulinresistenz, Glukoseintoleranz, Fettleibigkeit und metabolischem Syndrom3,4,5,6. Insulinresistenz ist nicht nur eine Manifestation der Krankheit, sondern es wird angenommen, dass sie zu ihrer Pathogenese beiträgt, indem sie die Wirkung des luteinisierenden Hormons im Eierstock verstärkt und dadurch zu einer erhöhten Androgenproduktion ^führt7,8. Es wird angenommen, dass die Insulinresistenz mehrere mögliche Ursprünge hat, aber Studien deuten darauf hin, dass sie auf abnormale Muster der Insulinrezeptorsignalisierung zurückzuführen sein ^könnte9,10. Studien haben die Insulinresistenz bei PCOS-Patienten unter Verwendung der Goldstandardtechnik der hyperinsulinämisch-euglykämischen Clamp11,12,13,14,15 untersucht. Frauen mit PCOS, unabhängig vom BMI, haben im Vergleich zu Kontrollen eine höhere Insulinresistenz. Die Insulinkontrolle über die Glukoseproduktion ist bei Störungen der Insulinresistenz, die zu einer übermäßigen Glukoseproduktion führen, beeinträchtigt. Zum Beispiel haben Diabetiker erhöhte Raten der Glukoneogenese und eine gestörte Unterdrückung der Glykogenolyse16. Darüber hinaus wurde bei diabetischen Ratten eine gestörte Unterdrückung der Glukoseproduktion ^beobachtet17. Obwohl Clamp-Studien eine Messung der Insulinresistenz liefern können, konzentrieren sich nur wenige Studien in PCOS auf die direkte Messung der Glukoseproduktion im Nüchtern- und Fütterungszustand. Dies erfordert die Verwendung einer nicht-radioaktiven Isotopenglukose-Tracer-Infusion und die Messung mittels Massenspektrometrie.

Tiermodelle wurden in der PCOS-Forschung ausgiebig verwendet. Sowohl schlanke als auch fettleibige PCOS-Murinenmodelle wurden durch pränatale, präpubertelle oder postpubertale Verabreichung von Androgenen ^erstellt18. Nagetier-PCOS-Modelle zeigen auch metabolische Unterschiede im Vergleich zu ihren jeweiligen Kontrollen. Frühere Daten aus unserem Labor zeigten abnormale Glukosetoleranztests (GTT) in PCOS-Mausmodellen (mager und fettleibig), die mit der menschlichen PCOS-Literatur ^{übereinstimmen19}. Die Verwendung eines schlanken und fettleibigen Tiermodells ermöglicht die weitere Untersuchung von Stoffwechselunterschieden. Insbesondere ermöglicht dieses Modell die Bewertung der Rate der Glukoseproduktion direkt unter Verwendung von Isotopenglukose-Tracern. Einer der am häufigsten verwendeten stabilen Isotopenglukose-Tracer ist [6,6-2H2]Glucose. Die [6,6-2H2]Glucoseanreicherung kann mit einem Pentaacetatderivat wie zuvor beschrieben gemessen ^werden20.

In dieser Studie war es unser Ziel, die Rate der hepatischen Glukoseproduktion im nüchternen und glukosereichen Zustand bei PCOS-Mäusen mit Isotopenglukoseinfusion zu messen. Diese Techniken können auf eine Vielzahl von Experimenten mit Glukosekinetik angewendet werden.

Protocol

Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Baylor College of Medicine genehmigt. 1. Herstellung von [6,6-2H2]Glucose Bereiten Sie einen Tag vor dem Eingriff den stabilen Isotopenglukose-Tracer in normaler Kochsalzlösung vor. Für dieses Experiment wurde [6,6-2H2]Glucose als Tracer zur Messung der Plasmaglukose-Erscheinungsrate verwendet.HINWEIS: In diesem Experiment wurde die …

Representative Results

Unter Verwendung zuvor beschriebener Isotopenverdünnungsgleichungen wurde die Gesamtplasmaglukoserate (glucoseRa) aus der M+2-Anreicherung von [6,6-2H2]Glucose unter nüchternen und glucosereichen Bedingungen unter Verwendung des Pentaacetatderivats21 berechnet. Unter stationären Bedingungen wird angenommen, dass die Rate des Auftretens von Glukose gleich der Rate des Verschwindens von Glukose ist. In der Kontrollgruppe betrug die GesamtglucoseRa 19,98 ± 2,53 mg…

Discussion

Hyperglykämie und abnormaler Glukosestoffwechsel / Homöostase sind Merkmale von PCOS. Der Blutzuckerspiegel wird durch eine Kombination von Glukose aus der Nahrung und Glukoseproduktion über Glykogenolyse und Glukoneogenese und Glykogenese unter der Kontrolle von Hormonen und Enzymen aufrechterhalten. Die hepatische Glukoseproduktion wird durch das Vorhandensein erhöhter zirkulierender Glukosespiegel unterdrückt. Bei Störungen des abnormalen Glukosestoffwechsels ist die Regulierung der Unterdrückung der G…

Materials

0.9% sodium chloride solution	McKesson	275595
10 mL BD Luer-Lok tip syringe	VWR	75846-756	Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution)
1-inch clear transpore tape	3M	70200400169
1-inch Labeling tape	Fisher	GS07F161BA	Brand is example
5 mL syringe containing heparanized saline flush	McKesson	191-MIH-2235	One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride)
5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets	Fisher Scientific	NC9891620	5 mm if animal is between 2 and 6 months
Acetone	Sigma-Aldrich	650501
Advanced hot plate stirrer	VWR	97042-602	Brand is example
BD 27 gauge 0.5 inch needles	Health Warehouse	A283952
BD 30 gauge 0.5 inch needles	Medvet	305106
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm	VWR	63019-004
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm	VWR	63019-004
Beaker, 1000 mL			Any brand
Caging pellets
Clear VOA glass vials with closed-top cap	Fisher Scientific	05-719-120	For storage of acetone and blood draw samples
Copper toothless alligator clamp for tourniquet	Amazon		Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper
D-(+)-glucose >99.5%	Sigma-Aldrich	G8270
D-glucose (6,6-D2, 99%)	Cambridge Isotope Laboratories, Inc.	DLM-349-PK
Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD	VWR	62999-042
Magnifying glass	Amazon		Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand
Microbalance	Ohaus Adventurer Pro	AV264C	Any similar model with 0.0001g accuracy can be used
Nalgene bottle, 500 mL	Sigma-Aldrich	B0158-12EA	Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom
PHD Ultra multi-syringe pump	Harvard Apparatus	70-3024A
Plexiglass sheet			Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion
Plexiglass sheets and dividers			Any brand; used to cage mice during infusion