Summary
يعد وخز الرأس القاعدي لنبات الفلفل الأسود طريقة قصيرة وموفرة للوقت لإتلافه. هنا ، قدمنا خطوات مفصلة مع مقطع فيديو لإصابة نباتات الفلفل الأسود.
Abstract
Piper nigrum L. (الفلفل الأسود) هو كرمة خشبية نموذجية تعد محصولا مهما اقتصاديا للتوابل في جميع أنحاء العالم. يتأثر إنتاج الفلفل الأسود بشكل كبير بمرض تعفن الجذور الناجم عن Phytophthora capsici ، والذي أثر بشكل خطير على تطور الصناعة كمشكلة "نقطة اختناق". ومع ذلك ، فإن الآلية الوراثية الجزيئية للمقاومة في الفلفل الأسود غير واضحة ، مما يؤدي إلى بطء التقدم في تطوير أنواع جديدة من الفلفل الأسود. يعد التلقيح الفعال ونظام أخذ العينات الدقيق ل Phytophthora capsici على نباتات الفلفل الأسود أمرا ضروريا لدراسة هذا التفاعل بين النبات ومسببات الأمراض. الهدف الرئيسي من هذه الدراسة هو إظهار منهجية مفصلة حيث يتم تلقيح الرأس القاعدي للفلفل الأسود ب Phytophthora capsici ، مع توفير مرجع لتلقيح نباتات الكرمة الخشبية. تم وخز الرأس القاعدي لنبات الفلفل الأسود لإتلافه ، وغطت الكريات الفطرية الثقوب الثلاثة للاحتفاظ بالرطوبة حتى يتمكن العامل الممرض من إصابة النبات جيدا. توفر هذه الطريقة طريقة أفضل لحل عدم الاستقرار الناجم عن طرق التلقيح التقليدية بما في ذلك غمر التربة أو غمس الجذر. كما يوفر وسيلة واعدة لدراسة طريقة العمل بين النباتات وغيرها من مسببات الأمراض النباتية التي تنقلها التربة في التربية الزراعية الدقيقة.
Introduction
الفلفل الأسود (Piper nigrum L.) هو متسلق خشبي وواحد من أهم محاصيل التوابل. يعرف باسم "ملك التوابل"1 ويزرع في أكثر من 40 دولة ومنطقة في جميع أنحاء آسيا وأفريقيا وأمريكا اللاتينية. تعفن الجذر Phytophthora هو المرض الأكثر تدميرا للفلفل الأسود ، ويسببه oomycete Phytophthora capsici. هذا العامل الممرض يصيب أيضا القرعيات والباذنجان والفلفل الحار والطماطم 2,3. مع الفلفل الأسود ، يمكن في بعض الأحيان تدمير محصول كامل بسبب هذا المرض. يتم تقييد التوسع في مناطق زراعة الفلفل نتيجة لعدم توفر الأصناف المقاومة ، مما أعاق بشكل كبير تطوير صناعة الفلفل الأسود الصينية. يعد التلقيح الفعال ونظام أخذ العينات الدقيق ل Phytophthora capsici على نباتات الفلفل الأسود أمرا ضروريا لدراسة هذا التفاعل بين النبات ومسببات الأمراض.
إن تحديد وفحص المقاومة في موارد البلازما الوراثية هو الشرط الأساسي للبحث في إمراض العامل الممرض وتربية واستخدام الأصناف المقاومة. النهج المستخدم على نطاق واسع هو استخدام مجموعة متنوعة من طرق تحديد الهوية على أساس الأنواع النباتية ومجموعات مسببات الأمراض. تشمل طرق تحديد الهوية الحالية تحديد السكان ، وتحديد الهوية الفردية ، وتحديد الأعضاء ، وتحديد الأنسجة ، وتحديد الخلايا ، وتحديد الهوية الكيميائية الحيوية ، وتحديد الهوية الجزيئية ، والتي تم تطويرها في السنوات الأخيرة 4,5. وقد تحقق نجاح في هذه المجالات، ولكن هناك أيضا العديد من المشاكل. بغض النظر عن الطريقة التي يتم اختيارها ، فإن المتطلبات الأساسية لتحديد مقاومة النبات متسقة ، بما في ذلك الأهداف الواضحة والنتائج الموثوقة والأساليب البسيطة والسريعة وسهلة التوحيد. يجب أيضا اتباع هذا المبدأ في تحديد مقاومة الفلفل الأسود.
في الظروف الميدانية الطبيعية ، يمكن أن يتأثر تحديد مقاومة الأمراض بالعديد من العوامل البيئية. لذلك ، اقترح استخدام الأوراق المنفصلة والجذور المروية في المختبر لتحديد مقاومة الأمراض. تم تلقيح الأوراق الصغيرة من النباتات السليمة في المختبر في المختبر ، وتم قياس منطقة الأوراق المريضة عن طريق تلقيح العامل الممرض من أجل تحديد مقاومة الأمراض للنباتات6. ومع ذلك ، لا يمكن استخدام تلقيح الأوراق في المختبر إلا لتحديد المقاومة العامة وليس لدراسات التفاعل الجزيئي. على الرغم من ذلك ، غالبا ما تظهر حالة مقاومة الأمراض في تلقيح الجذر المروي ، مما يسبب عدم اليقين في دراسة متابعة التربية الجزيئية لمقاومة الأمراض. لذلك ، تعد طرق الكشف الداخلية السريعة والبسيطة ضرورية. تهدف هذه الدراسة إلى توفير طريقة لتحديد المقاومة في المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد نباتات قطع الفلفل الأسود للعدوى
- خذ قطعا من خمس عقد ، طوله حوالي 40 سم وقطره 0.5 سم ، من فرع صحي وينمو بقوة من الفلفل الأسود باستخدام سكين تقليم مطهر أو مفصلات. تقليم العقد الثلاث السفلى من الفروع البلاجيوتروبيكية ، مع ترك العقدتين العلويتين مع ما يقرب من 10 أوراق سليمة.
- تحضير الركيزة الجذرية التي تحتوي على التربة وروث الحيوانات (روث البقر أو روث الأغنام) بنسبة 1: 1. قم بتعقيم ركيزة التجذير عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- أدخل القصاصات في ركيزة التجذير بزاوية 50 درجة تقريبا ، مع لمس العقدة الثالثة فقط لسطح الركيزة وبرعم الإبط على هذه العقدة فوق الركيزة.
ملاحظة: الحقيبة المستخدمة هنا لها الأبعاد التالية: ارتفاع 40-60 سم ، قطر 25-30 سم. - صب 10-20 لتر من الماء على جذور النبات. ضع القصاصات في دفيئة ذات ظل 90٪ عند درجة حرارة 25-30 درجة مئوية للتأصيل والنمو.
2. انتشار Phytophthora capsici (P. capsici)
ملاحظة: يتم الاحتفاظ بمخزون من ثقافة الكابسيتشي Phytophthora في مختبر وقاية النباتات التابع لمعهد أبحاث التوابل والمشروبات ، الأكاديمية الصينية للعلوم الزراعية الاستوائية7.
- تنظف درنات البطاطس بالفرشاة وتنظف تحت ماء الصنبور الجاري ثم تقطع 200 غرام من البطاطس إلى مكعبات بحجم 1 سم3. ضع بعض المكعبات في كوب يحتوي على 800 مل من الماء المقطر المزدوج (ddH2O) واغليها لمدة 20 دقيقة.
- قم بتصفية المرق من خلال شاش مزدوج باستخدام ترشيح الجاذبية. تحضير أجار سكر العنب البطاطس (PDA) عن طريق إضافة 20 غرام من سكر العنب و 15 غرام من الأجار إلى الترشيح ورفع الحجم حتى 1 لتر مع ddH2O. أوتوكلاف الخليط على حرارة 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة8.
- صب 20 مل من المساعد الشخصي الرقمي المعقم في شكل سائل في طبق بتري دائري قطره 9 سم داخل غطاء تدفق الهواء الرقائقي. اترك ألواح PDA مع أغطية مفتوحة داخل غطاء تدفق الهواء الرقائقي بين عشية وضحاها كوسيلة لمنع التكثيف.
- استخدم حلقة التلقيح لالتقاط الفطريات من مخزون Phytophthora capsici داخل أنبوب اختبار. ضع اللقاح مع الجانب الفطري على اتصال مع PDA في طبق بتري.
3. عدوى الفلفل الأسود
- حضانة المرض
- تحديد منطقة 5 سم فوق سطح الركيزة وبالقرب من الجذور على الجذع للتلقيح.
- قم بإخراج قرص من الفطريات قطره 0.5 سم عند الحافة المتنامية لثقافة Phytophthora capsici على PDA في طبق بتري باستخدام حفار سدادة.
- قم بإتلاف الجذع باستخدام إبرة حقنة وقم بعمل ثلاثة ثقوب في نمط مثلث في منطقة التلقيح المحددة. قم بتغطية كل ثقب بقرص mycelial. ضع الثقوب بالقرب من بعضها البعض لضمان تغطية المنطقة المصابة بالكامل بالأقراص الفطرية.
- قم بتغطية الأقراص الفطرية بمنصات قطنية مبللة معقمة كوسيلة لمنع التجفيف. اربط الوسادة على الجذع بشريط من البولي إيثيلين للحفاظ على موضع أقراص التلقيح.
ملاحظة: في الساعة 8 بعد التلقيح ، تحولت الثقوب الملقحة إلى اللون الأسود وامتدت الآفة مع مرور الوقت. تحولت الأوراق إلى اللون الأصفر وسقطت ، وتوفي النبات الملقح بعد 7-10 أيام من التلقيح. لم تتطور أي آفات في محطات التحكم. تم التعبير عن معظم الجينات بشكل مختلف بعد التلقيح باستخدام Phytophthora capsici مقارنة بالمجموعة الضابطة. أظهر التحليل النسيجي المرضي للأنسجة المصابة أن Phytophthora capsici استعمر في xylem.
- قم بأخذ عينات من المواد النباتية ذات الأهمية وتخزينها عند -80 درجة مئوية في النيتروجين السائل لاستخدامها في الدراسات اللاحقة.
ملاحظة: تم إعداد النيتروجين السائل والأكياس البلاستيكية وأقلام العلامات ومقصات الفروع وغيرها من المواد قبل التجارب. - بعد أخذ عينات من المواد النباتية المحددة للاستخدام ، قم بتعقيم جميع المواد النباتية المتبقية ، وبقايا ثقافة Phytophthora capsici ووسط الاستزراع ، وجميع الأدوات والأدوات المختبرية المستخدمة في أعمال التلقيح هذه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح الشكل 1 أعراض أوراق الفلفل الأسود بعد تلقيح P. capsici. يوضح الشكل 2 أعراض سيقان الفلفل الأسود بعد تلقيح P. capsici. أصاب العامل الممرض الفلفل الأسود في الجذع القاعدي. الأعراض بما في ذلك اصفرار الأوراق ، وظهور الذبول ، وتحمير xylem ، وسواد الأوعية الدموية الذي يظهر تدريجيا. يوضح الشكل 3 معظم الجينات التي تم التعبير عنها بشكل مختلف بعد التلقيح باستخدام Phytophthora capsici مقارنة بالمجموعة الضابطة. وقد أظهر الشكل 4 أن Phytophthora capsici مستعمر في xylem من خلال التحليل النسيجي المرضي للأنسجة المصابة.
الشكل 1: أعراض أوراق الفلفل الأسود بعد تلقيح P. capsici 7. CK: المجموعة الضابطة. التلقيح: بعد التلقيح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: أعراض سيقان الفلفل الأسود بعد تلقيح P. capsici 7. التلقيح: بعد التلقيح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: ملامح التعبير التفصيلية للجينات في جذور الفلفل الأسود. تشير أشرطة الخطأ في الأشكال إلى الخطأ القياسي لمستويات التعبير من ثلاثة تكرارات بيولوجية. تشير CK-8 و CK-12 و CK-24 و CK-48 و 8 و 12 و 24 و 48 على المحور x إلى 8 و 12 و 24 و 48 ساعة على التحكم و 8 و 12 و 24 و 48 ساعة ، على التوالي ، بعد التطعيم باستخدام P. capsici. يمثل المحور y مستوى التعبير النسبي مقارنة باليوبيكوتين. يمثل كل عمود القيمة المتوسطة زائد SD (الانحراف المعياري) من ثلاثة نسخ بيولوجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التحليل النسيجي المرضي للأنسجة المصابة. المقارنة بين تلطيخ التولويدين الأزرق O وحده (العمود الأيسر) والأزرق القطني والزعفرانين O تلطيخ مزدوج (العمود الأيمن) (20X). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة ، تم وخز الرأس القاعدي للتلف وتوفير نظام تلقيح فعال في نبات الفلفل الأسود. ثم غطت الكريات الفطرية الثقوب الثلاثة للاحتفاظ بالرطوبة وتمكين العامل الممرض من إصابة النبات جيدا. بعد التلقيح ، تحولت الأوراق إلى اللون الأصفر وسقطت وماتت النباتات الملقحة. لم تتطور أي آفات في محطات التحكم. تم التعبير عن معظم الجينات بشكل مختلف بعد التلقيح باستخدام Phytophthora capsici مقارنة بالمجموعة الضابطة. الأمراض الفطرية مسؤولة عن الاضطرابات الهيكلية والفسيولوجية في عدد كبير من المحاصيل ، مما يؤدي إلى انخفاض الإنتاجية والخسائر الاقتصادية لمنتجيها. توفر الدراسات الهيكلية التي تستخدم التقنيات النسيجية حول طريقة اختراق واستعمار الأنسجة النباتية بواسطة الفطريات مؤشرا مفصلا للتفاعلات بين العامل الممرض والأنسجة النباتية. وقد كشفت هذه الدراسات عن جوانب مهمة للمساعدة في فهم الدورة الأحادية للأمراض. أظهر التحليل النسيجي المرضي للأنسجة المصابة أن Phytophthora capsici مستعمر في xylem. توفر هذه الطريقة وسيلة أفضل لحل عدم الاستقرار الناجم عن طرق التلقيح التقليدية بما في ذلك غمر التربة أو غمس الجذر. يعد التلقيح الفعال ونظام أخذ العينات الدقيق ل Phytophthora capsici على نباتات الفلفل الأسود أمرا ضروريا لدراسة هذا التفاعل بين النبات ومسببات الأمراض. كما يوفر وسيلة واعدة لدراسة طريقة العمل بين النباتات وغيرها من مسببات الأمراض النباتية التي تنقلها التربة في التربية الزراعية الدقيقة.
في الوقت نفسه ، يمثل هذا البروتوكول طريقة أكثر كفاءة لتوفير مرجع لحضانة الكرمة الخشبية. في الدراسات السابقة ، تم تلقيح مسببات الأمراض عن طريق غمس الجذر مع تعليق بوغ مستزرع في وسط V89. يستغرق الأمر 7 أيام حتى يكون تعليق البوغ جاهزا ، في حين أن استخدام المساعد الشخصي الرقمي لزراعة Phytophthora capsici يستغرق 5 أيام فقط. تم إغلاق لوحة PDA باستخدام شريط جراحي قابل للنفاذ كوسيلة لتجنب التلوث من البكتيريا والفطريات الأخرى. تم الاحتفاظ بالثقافات في درجة حرارة الغرفة. يمكن للطريقة المستخدمة في هذه الدراسة توفير المزيد من الوقت وتنفيذها بسرعة أكبر. الفلفل الأسود هو كرمة خشبية تحتوي على العديد من السكريات والفينولات10 ، وتحدث الجراثيم الحيوانية التي تنتجها Phytophthora capsici بشكل عام في التربة ، مما يجعل من الصعب إصابة كروم الفلفل الأسود والتسبب في عدم استقرار العدوى في الجذر11. يوفر هذا البروتوكول نتائج أفضل ، مما يتيح تفاعلا قويا بين نباتات الكرمة ومسببات الأمراض التي تنقلها التربة. الكشف عن العملية الديناميكية بين النباتات ومسببات الأمراض مرئي ومريح.
طريقة جذر الري سريعة وموفرة للوقت ، لكن المشكلة لا تزال دون حل بالنسبة للفلفل الأسود. Phytophthora capsici هو أحد مسببات الأمراض التي تنقلها التربة والتي تصيب عموما جذور النباتات عن طريق sporangia و zoospores12. في الطبيعة ، يمكن أن ينتشر sporangia عن طريق المطر والري. بمجرد أن تصبح جراثيم الحيوانات ملتصقة بسطح النبات ، قد تتطور الأنابيب الجرثومية بسرعة وتخترق الأنسجة النباتية ، مما يؤدي إلى الإصابة13,14. هذا يمكن أن يسبب عدم اليقين من أن اختيار hyphae كمصدر للعدوى سيكون مشابها لتعليق بوغ. تبدأ الطريقة المستخدمة في هذه الدراسة بوخز الرأس القاعدي لنبات الفلفل الأسود لإتلافه. ثم يتم تغطية المنطقة المتضررة ب Phytophthora capsici ويتم الاحتفاظ بالرطوبة ، مما يضمن أن العامل الممرض يمكن أن يصيب النبات جيدا. هذه الطريقة أفضل في حل عدم الاستقرار الناجم عن طرق التلقيح التقليدية بما في ذلك غمر التربة أو غمس الجذر. كما أنها طريقة واعدة لدراسة طريقة العمل بين النباتات وغيرها من مسببات الأمراض النباتية التي تنقلها التربة في التربية الزراعية الدقيقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل ماليا من قبل البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (2020YFD1001200) ، ونظام البحوث الزراعية الصيني (CARS-11) ، وصندوق الأبحاث المحدد لمنصة الابتكار للأكاديميين في مقاطعة هاينان (YSPTZX202154) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة هاينان الصينية (321RC652) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في الصين (رقم 31601626).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar powder | Solarbio | A8190 | |
| Clean bench | Haier | ||
| Dextrose | Xilong Scientific | 15700501 | |
| High temperature sterilizing oven | Zaelway | ||
| Petri dish plates | Biosharp | BS-90-D |
References
- Gordo, S. M., et al. High-throughput sequencing of black pepper root transcriptome. BMC Plant Biology. 12 (1), (2012).
- Leonian, L. H. Stem and fruit blight of Peppers caused by Phytophthora capsici sp. Nov. Phytopathology. 12 (9), 401-408 (1922).
- Ding, X., et al. Priming maize resistance by its neighbors: Activating 1,4-benzoxazine-3-ones synthesis and defense gene expression to alleviate leaf disease. Frontiers in Plant Science. 6, 830 (2015).
- Fonseca, C. E. L., Vianda, D. R., Hansen, J. L., Pell, A. N. Associations among forage quality traits, vigor, and disease resistance in alfalfa. Crop Science. 39 (5), 1271-1276 (1999).
- Altier, N. A., Thies, J. A. Identification of resistance to Pythium seedling disease in Alfalfa using a culture plate method. Plant Disease. 79 (4), 341-345 (1995).
- Pratt, R. G., Rowe, D. E. Evaluation of simplified leaf inoculation procedures for identification of quantitative resistance to Sclerotinia trifoliorum in Alfalfa seedling. Plant Disease. 82 (10), 1161-1164 (1998).
- Hao, C., et al. De novo transcriptome sequencing of black pepper (Piper nigrum L.) and an analysis of genes involved in phenylpropanoid metabolism in response to Phytophthora capsici. BMC Genomics. 17 (1), 1-14 (2016).
- Dong, C., et al. Field inoculation and classification of maize ear rot caused by Fusarium verticillioides. Bio-protocol. 8 (23), 3099 (2018).
- English, J. T., Laday, M., Bakonyi, J., Schoelz, J. E., Érsek, T. Phenotypic and molecular characterization of species hybrids derived from induced fusion of zoospores of Phytophthora capsica and Phytophthora nicotianae. Mycological Research. 103 (8), 1003-1008 (1999).
- Chatterjee, S., et al. Antioxidant activity of some phenolic constituents from green pepper (Piper nigrum L.) and fresh nutmeg mace (Myristica fragrans). Food Chemistry. 101 (2), 515-523 (2007).
- Pfender, W. F. Production of sporangia and release of zoospores by Phytophthora megasperma in soil. Phytopathology. 67 (5), 657-663 (1977).
- Nagila, A., Schutte, B. J., Sanogo, S., Idowu, O. J. Chile pepper sensitivity to mustard seed meal applied after crop emergence. HortScience. 56 (2), 1-7 (2021).
- Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsica. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
- Hardham, A., Gubler, F. Polarity of attachment of zoospores of a root pathogen and pre-alignment of the emerging germ tube. Cell Biology International Reports. 14 (11), 947-956 (1990).
