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Biochemistry

एक रिपोर्टर आधारित सेलुलर परख निगरानी Splicing दक्षता के लिए

Published: September 15, 2021 doi: 10.3791/63014
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Basic Medical Sciences, College of Medicine-Phoenix, University of Arizona

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन करता है एक minigene रिपोर्टर परख splicing पर 5'-splice साइट उत्परिवर्तन के प्रभाव की निगरानी करने के लिए और उत्परिवर्तन प्रेरित splicing निषेध के बचाव के लिए suppressor U1 snRNA विकसित करता है. रिपोर्टर और दमनकारी U1 snRNA निर्माणों को हेला कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है, और प्राइमर एक्सटेंशन या आरटी-पीसीआर द्वारा स्प्लिसिंग का विश्लेषण किया जाता है।

Abstract

जीन अभिव्यक्ति के दौरान, प्री-एमआरएनए स्प्लिसिंग के महत्वपूर्ण चरण में स्प्लिस साइटों की सटीक पहचान और स्प्लिसोसोमल परिसरों की कुशल असेंबली शामिल है, जो एक्सोन में शामिल हो जाते हैं और परिपक्व एमआरएनए के साइटोप्लाज्मिक निर्यात से पहले इंट्रोन को हटा देते हैं। Splicing दक्षता splice साइटों पर उत्परिवर्तन की उपस्थिति, ट्रांस-अभिनय splicing कारकों के प्रभाव, या चिकित्सीय की गतिविधि से बदला जा सकता है। यहां, हम एक सेलुलर परख के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिसे किसी भी दिए गए एक्सोन की स्प्लिसिंग दक्षता की निगरानी के लिए लागू किया जा सकता है। परख एक अनुकूलन प्लास्मिड एन्कोडेड 3-एक्सोन / 2-इंट्रोन मिनीजीन रिपोर्टर का उपयोग करता है, जिसे क्षणिक अभिकर्मक द्वारा स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त किया जा सकता है। पोस्ट-अभिकर्मक, कुल सेलुलर आरएनए को अलग किया जाता है, और रिपोर्टर एमआरएनए में एक्सोन स्प्लिसिंग की दक्षता या तो प्राइमर एक्सटेंशन या अर्ध-मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर) द्वारा निर्धारित की जाती है। हम वर्णन करते हैं कि कैसे 5 'splice-साइट उत्परिवर्तन से जुड़े रोग के प्रभाव को रिपोर्टर में उन्हें पेश करके निर्धारित किया जा सकता है; और इन उत्परिवर्तनों का दमन U1 छोटे परमाणु आरएनए (snRNA) के साथ सह-अभिकर्मक द्वारा कैसे प्राप्त किया जा सकता है, जो अपने 5 'क्षेत्र में प्रतिपूरक उत्परिवर्तन ों को ले जाने का निर्माण करता है जो पूर्व-mRNA में एक्सोन-इंट्रोन जंक्शनों पर 5'-स्प्लिस साइटों के साथ बेसपेयर करता है। इस प्रकार, रिपोर्टर का उपयोग चिकित्सीय U1 कणों के डिजाइन के लिए उत्परिवर्ती 5 'स्प्लिस-साइटों की मान्यता में सुधार करने के लिए किया जा सकता है। सीआईएस-अभिनय नियामक साइटों का सम्मिलन, जैसे कि स्प्लिसिंग एन्हांसर या साइलेंसर अनुक्रम, रिपोर्टर में भी एक विशिष्ट वैकल्पिक स्प्लिसिंग कारक द्वारा मध्यस्थता किए गए विनियमन में U1 snRNP की भूमिका की जांच करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। अंत में, कोशिकाओं को व्यक्त करने वाले रिपोर्टर को छोटे अणुओं के साथ इनक्यूबेट किया जा सकता है ताकि संरचनात्मक पूर्व-एमआरएनए स्प्लिसिंग पर संभावित चिकित्सीय के प्रभाव को निर्धारित किया जा सके या उत्परिवर्ती 5 'स्प्लिस साइटों को ले जाने वाले एक्सोन पर। कुल मिलाकर, रिपोर्टर परख को मौलिक splicing तंत्र और splicing से जुड़े रोगों का अध्ययन करने के लिए विभिन्न स्थितियों में splicing दक्षता की निगरानी करने के लिए लागू किया जा सकता है।

Introduction

प्री-एमआरएनए स्प्लिसिंग एक आवश्यक प्रसंस्करण कदम है जो गैर-कोडिंग इंट्रोन को हटा देता है और परिपक्व एमआरएनए बनाने के लिए कोडिंग एक्सोन को ठीक से लिगेट करता है। एक्सोन-इंट्रॉन जंक्शनों पर आम सहमति अनुक्रमों की पहचान, जिसे 5'-स्प्लिस साइट और 3'-स्प्लिस साइट के रूप में संदर्भित किया जाता है, स्प्लिसिंग मशीनरी के घटकों द्वारा स्प्लिसिंग प्रक्रिया शुरू करता है। U1 छोटे परमाणु राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (snRNP) पूर्व-mRNA1 के लिए U1 snRNA के आधार युग्मन द्वारा 5'-splice साइट को पहचानता है। आनुवंशिक रूप से विरासत में मिले उत्परिवर्तन जो 5'-splice साइट अनुक्रमों को बदलते हैं, वे कई बीमारियों 2,3 से जुड़े होते हैं। यह भविष्यवाणी की जाती है कि उत्परिवर्ती 5'-स्प्लिस साइटों के साथ U1 snRNA के बेसपेयरिंग का नुकसान aberrant splicing का कारण बनता है, जो प्रभावित प्रतिलेख के अनुवाद से समझौता कर सकता है। splicing दोषों को सही करने के लिए एक संभावित चिकित्सीय दृष्टिकोण में संशोधित U1 snRNA द्वारा उत्परिवर्तन का दमन शामिल है जो अपने 5'-क्षेत्र में प्रतिपूरक न्यूक्लियोटाइड परिवर्तनों को ले जाता है जो 5'-splice साइट के साथ बेसपेयर करता है। इस तरह के संशोधित U1 snRNAs, जिसे एक्सोन विशिष्ट U1 snRNas के रूप में भी जाना जाता है, को splicing दोषों को उलटने में प्रभावी पाया गया है, जिसके परिणामस्वरूप बचाए गए mRNA4,5,6,7,8 से प्रोटीन अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई है।

यहाँ, हम U1 snRNP पूरक परख का वर्णन करते हैं, एक रिपोर्टर-आधारित सेलुलर splicing परख जो एक एक्सोन के splicing पर 5'-ss उत्परिवर्तन के प्रभाव के मूल्यांकन की अनुमति देता है और एक्सन समावेशन के बचाव को सक्षम करने के लिए संशोधित U1 snRNAs के विकास के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है। हम प्राइमर एक्सटेंशन और आरटी-पीसीआर द्वारा spliced रिपोर्टर टेपों की निगरानी के लिए प्रोटोकॉल भी प्रदान करते हैं, और प्राइमर एक्सटेंशन और आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा संशोधित U1 snRNAs की अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए।

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Protocol

1. अभिकर्मकों और buffers

नोट: वैक्यूम फिल्टर का उपयोग करके सभी नसबंदी एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में 0.2 μm polyethersulfone (PES) झिल्ली के साथ किया जाना चाहिए।

  1. 1.0 मिलीलीटर डायथिलपाइरोकार्बोनेट (डीईपीसी) को विआयनीकृत पानी के 1.0 एल में जोड़कर आरएनेज-मुक्त पानी तैयार करें, कमरे के तापमान (आरटी) पर कम से कम 1 घंटे के लिए मिश्रण करें, दो बार आटोक्लेव करें, और फिर उपयोग से पहले आरटी को ठंडा करें।
  2. DMEM पाउडर (13.4 ग्राम), सोडियम बाइकार्बोनेट के 3.7 ग्राम, भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), पेनिसिलिन, और स्ट्रेप्टोमाइसिन के ~ 800 मिलीलीटर बाँझ विआयनीकृत पानी के एक पैकेट को मिलाकर Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) तैयार करें। डीएमईएम में पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन की अंतिम एकाग्रता क्रमशः 50 यू / एमएल और 50 μg / एमएल होनी चाहिए। पीएच को 7.4 में समायोजित करें और फिर बाँझ विआयनीकृत पानी के साथ 1.0 एल तक की मात्रा बनाएं। निस्पंदन द्वारा निष्फल करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. 25.6 ग्राम डिसोडियम हाइड्रोजन हेप्टाहाइड्रेट (Na2HPO4· 7H2O), पोटेशियम डाइहाइड्रोजन फॉस्फेट (KH2PO4) के 2 ग्राम, पोटेशियम क्लोराइड (KCl) के 2 ग्राम, और सोडियम क्लोराइड (NaCl) के 800 ग्राम deionized पानी के लिए 800 mL. मिश्रण को भंग करने के लिए और 1.0 एल करने के लिए मात्रा बनाने के लिए निस्पंदन द्वारा निष्फल और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  4. 0.5 M एथिलीन डायमाइन टेट्रा-एसिटिक एसिड (EDTA) को 186.1 ग्राम Na2• EDTA• 2H2O को विआयनीकृत पानी के ~ 800 मिलीलीटर में भंग करके तैयार करें। पीएच को 8.0 में समायोजित करें और फिर बाँझ विआयनीकृत पानी के साथ 1.0 एल तक मात्रा बनाएं। निस्पंदन द्वारा निष्फल करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. 10x ट्रिप्सिन (2.5%), 0.5 M EDTA के 2 mL के 100 mL को मिलाकर 1x ट्रिप्सिन-EDTA समाधान तैयार करें, और 1x PBS जोड़ें 1.0 L तक निस्पंदन और 50 mL शंक्वाकार ट्यूबों में एलीकोट द्वारा निष्फल करें। 1-2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या दीर्घकालिक उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
  6. 15 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा के लिए 14.4 मिलीलीटर फॉर्मामाइड और 0.5 एम ईडीटीए के 0.6 एमएल को मिलाकर 2x फॉर्मामाइड डीएनए / आरएनए लोडिंग डाई तैयार करें। 0.02% की अंतिम एकाग्रता के लिए ब्रोमोफेनोल नीले और जाइलीन साइनॉल पाउडर जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: Formamide विषाक्त और संक्षारक है। अतिरिक्त सुरक्षा अनुशंसाओं के लिए सामग्री सुरक्षा डेटा पत्रक पढ़ें.
  7. 5x Tris / Borate / EDTA (5x TBE) बफर तैयार करें tris आधार के 54.0 ग्राम, बोरिक एसिड के 27.5 ग्राम, और 0.5 M EDTA के 20 mL को ~ 800 mL विआयनीकृत पानी में मिलाकर। मिश्रण को भंग करने के लिए और विआयनीकृत पानी के साथ 1.0 एल करने के लिए मात्रा बनाने के लिए।
  8. यूरिया-पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (यूरिया-पेज) समाधान तैयार करें, 5x टीबीई के 200 एमएल, 40% के 250 एमएल 19: 1 बीआईएस / एक्रिलामाइड, और 450.5 ग्राम यूरिया को मिलाकर। फिर 1.0 एल तक विआयनीकृत पानी जोड़ें जब तक कि सामग्री पूरी तरह से भंग न हो जाए, तब तक मिश्रण करें, फिर निस्पंदन द्वारा निष्फल करें, और एक एम्बर ग्लास बोतल में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: Bis/acrylamide विषाक्त है। अतिरिक्त सुरक्षा प्रक्रियाओं के लिए सामग्री सुरक्षा डेटा शीट पढ़ें।
  9. विआयनीकृत पानी के 10 मिलीलीटर में एपीएस के 1 ग्राम को भंग करके 10% अमोनियम परसल्फेट (एपीएस) तैयार करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. रिपोर्टर और U1 snRNA plasmids के साथ HeLa कोशिकाओं के Cotransfection

नोट: हेला कोशिकाओं का अभिकर्मक एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ परिस्थितियों के तहत किया जाना चाहिए। जैविक सुरक्षा कैबिनेट में पेश किए जाने से पहले सभी सामग्रियों की बाहरी सतह को 70% इथेनॉल के साथ छिड़काव किया जाना चाहिए।

  1. DMEM में हेला कोशिकाओं को 5% CO2 के साथ 37 °C इनक्यूबेटर में बनाए रखें, जब कोशिकाएं लगभग 80-90% confluent होती हैं।
  2. HeLa कोशिकाओं को पास करने के लिए, खर्च किए गए माध्यम को एस्पिरेट करें और फिर 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एमएम ईडीटीए युक्त 0.25% ट्रिप्सिन के 3 एमएल के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  3. इनक्यूबेशन के बाद, ताजा DMEM के 7 मिलीलीटर जोड़ें। सेल निलंबन को 10 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें, 5 मिनट के लिए 1,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  4. ताजा DMEM के 10 मिलीलीटर में सेल गोली को फिर से निलंबित करें, और फिर 20% संगम पर एक नए ऊतक संस्कृति पकवान पर कोशिकाओं को प्लेट करें।
  5. क्षणिक अभिकर्मकों के लिए, एक स्वच्छ हेमोसाइटोमीटर स्लाइड के साथ हेला कोशिकाओं की गणना करें और 2.5 x 105 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व के साथ एक निलंबन तैयार करें।
  6. बीज 1.0 मिलीलीटर 2.5 x 105 कोशिकाओं / एमएल हेला सेल निलंबन के प्रत्येक कुएं में 12-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  7. अगले दिन, खर्च किए गए माध्यम को एस्पिरेट करें और सीरम के साथ 0.8 मिलीलीटर ताजा डीएमईएम जोड़ें।
  8. Dup51 या Dup51p रिपोर्टर प्लास्मिड के 0.2 μg, pcDNA, pNS6U1, या pNS6U1-5a प्लास्मिड के 1.8 μg, और एक नए 1.5 mL microcentrifuge ट्यूब में अभिकर्मक माध्यम के 100 μL जोड़कर समाधान तैयार करें।
  9. सभी नमूनों के लिए समाधान II का एक मास्टर मिश्रण तैयार करने के लिए अभिकर्मक माध्यम के 100 μL और प्रति नमूना अभिकर्मक अभिकर्मक के 4.0 μL जोड़कर transfected किया जा करने के लिए।
  10. समाधान I युक्त प्रत्येक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में समाधान II के 100 μL को जोड़कर अभिकर्मक मिश्रण तैयार करें।
  11. भंवर अभिकर्मक 15 s के लिए मिश्रण करता है, RT पर 10 s के लिए 3,000 x g पर एक tabletop microcentrifuge में centrifuge, और फिर 5 मिनट के लिए RT पर इनक्यूबेट करें।
  12. 12-अच्छी तरह से HeLa सेल प्लेट के एक कुएं में अभिकर्मक मिश्रण के सभी 200 μL जोड़ें ताकि प्रति अच्छी तरह से 1.0 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा प्राप्त की जा सके और प्लेट को 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जा सके।
  13. इनक्यूबेशन बाद, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध guanidine thiocyanate और फिनोल समाधान के साथ transfected HeLa कोशिकाओं से आरएनए निकालें।
    नोट: इस अभिकर्मक में फिनोल होता है और इस चरण को धुएं के हुड में किया जाना चाहिए। निकाले गए आरएनए के पुन: निलंबन के लिए डीईपीसी उपचारित पानी के उपयोग की सिफारिश की जाती है।
    1. खर्च किए गए माध्यम को एस्पिरेट करें और प्रत्येक कुएं में अभिकर्मक के 500 μL जोड़ें। 5 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
    2. ऊपर और नीचे pipetting द्वारा homogenize. फिर समाधान को एक नए 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    3. क्लोरोफॉर्म के 100 μL और 15 s के लिए भंवर जोड़ें।
    4. आरटी में 15 मिनट के लिए 12,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
    5. आरएनए युक्त 200 μL, एक नई 1.5 mL माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब के लिए शीर्ष जलीय परत हस्तांतरण।
    6. प्रत्येक आरएनए नमूने में ग्लाइकोजन के 2 μg और isopropanol के 200 μL जोड़ें। ट्यूबों को उलटकर मिलाएं।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 12,000 x g पर centrifugation द्वारा आरएनए अवक्षेप ले लीजिए।
    8. निकालें और आरएनए गोली परेशान किए बिना supernatant त्याग.
    9. 70% इथेनॉल के 1.0 मिलीलीटर जोड़कर, ट्यूबों को उलटकर, और चरण 2.13.7 में वर्णित सेंट्रीफ्यूजिंग द्वारा छर्रे को दो बार धोएं।
    10. हवा आरटी पर ~ 10-20 मिनट के लिए गोली सूखी और RNase मुक्त पानी के 10-20 μL में आरएनए resuspend.
    11. Desjardins और Conklin9 द्वारा वर्णित के रूप में 260 nm पर absorbance को मापने के द्वारा आरएनए एकाग्रता निर्धारित करें।
  14. प्राइमर एक्सटेंशन के साथ आगे बढ़ें या -20 डिग्री सेल्सियस में आरएनए नमूनों को स्टोर करें। पृथक आरएनए को 6-12 महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

3. ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के 32P-लेबलिंग

नोट: 32P-ATP और 32P-लेबल वाले ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के उपयोग से जुड़े चरणों को अधिकृत संस्थागत संस्थाओं से अनुमोदन के साथ प्रशिक्षित व्यक्तियों द्वारा एक ऐक्रेलिक ढाल के पीछे किया जाना चाहिए। नीचे वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स, Dup3r और U17-26-R, और यूरिया-पेज के लिए मार्करों के लेबलिंग के लिए किया जा सकता है। डीईपीसी उपचारित जल के उपयोग की सिफारिश ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स और आकार बहिष्करण मोतियों के पुन: निलंबन के लिए की जाती है।

  1. एक 1.5 mL माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब के लिए, ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड, T4 पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेज (T4 PNK), T4 PNK बफर, और 32P-ATP जोड़ें जैसा कि तालिका 1 में वर्णित है। मिश्रण में 32P-ATP अंतिम जोड़ें; यह महत्वपूर्ण है।
    नोट:: रेडियोधर्मी समाधान के अलावा के लिए, फ़िल्टर युक्तियों के उपयोग की सिफारिश की है।
  2. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में इनक्यूबेट करें।
  3. जबकि लेबलिंग प्रतिक्रियाएं इनक्यूबेट कर रही हैं, आकार बहिष्करण मोतियों को 25 केडीए आणविक वजन के साथ फिर से निलंबित कर दिया गया है जो धीरे से ~ 10 सेकंड के लिए भंवर करके काट दिया गया है।
    नोट: आकार बहिष्करण मोतियों को निर्माता के निर्देशों के अनुसार तैयार किया जाना चाहिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर 25% इथेनॉल में 50% निलंबन के रूप में संग्रहीत किया जाना चाहिए।
  4. एक 1.5 mL संग्रह ट्यूब में रखा एक डिस्पोजेबल मिनी कॉलम के लिए resuspended मोतियों के 600 μL स्थानांतरित करके और मनका स्टॉक 4 डिग्री सेल्सियस करने के लिए वापस करके कॉलम तैयार करें।
  5. आरटी में 1 मिनट के लिए 2,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज और प्रवाह के माध्यम से त्याग दें।
  6. स्तंभ के लिए RNase मुक्त पानी के 300 μL जोड़कर मोतियों धोलें.
  7. चरण 3.5 दोहराएँ। और 3.6। दो बार और एक नया 1.5 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के लिए मिनी कॉलम हस्तांतरण.
  8. आकार-बहिष्करण मनका स्तंभ और सेंट्रीफ्यूज पर 5000 x g पर आरटी पर 1 मिनट के लिए किनेज प्रतिक्रिया मिश्रण जोड़ें।
  9. 32P-लेबल वाले ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड वाले प्रवाह को इकट्ठा करें और सहेजें, और एक ऐक्रेलिक अपशिष्ट बॉक्स में सभी युक्तियों और ट्यूबों को छोड़ दें।
  10. 2.5 μM की अंतिम सांद्रता के लिए 32P-लेबल ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड को पतला करने के लिए RNase-मुक्त पानी के 20 μL जोड़ें।
    नोट: यूरिया-पेज जैल पर लोड करने के लिए आवश्यक के रूप में लेबल मार्करों को पतला करें।
  11. लेबल किए गए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड को एक ऐक्रेलिक माइक्रोट्यूब बॉक्स में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या प्राइमर एक्सटेंशन विश्लेषण के साथ आगे बढ़ें।

4. प्राइमर विस्तार द्वारा spliced रिपोर्टर टेपों का विश्लेषण

नोट: उपयोग से पहले एक RNase निष्क्रिय अभिकर्मक के साथ सतहों और उपकरणों को साफ करने की सिफारिश की जाती है।

  1. अलग 200 μL माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में हेला कोशिकाओं से निकाले गए आरएनए के 2.0 μg जोड़ें और 6.55 μL तक मात्रा बनाने के लिए RNase-मुक्त पानी जोड़ें।
  2. तालिका 2 में दिखाए गए अनुसार पतला 32P-Dup3r और dNTPs के साथ मास्टर मिक्स I तैयार करें और आरएनए नमूनों वाली प्रत्येक पीसीआर ट्यूब में मिश्रण का 0.9 μL जोड़ें।
  3. ट्यूबों को इनक्यूबेट करें, पहले 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर और फिर 1 मिनट के लिए बर्फ पर।
  4. 5x पहले स्ट्रैंड बफर, dithiothreitol (डीटीटी), RNase अवरोधक, और रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज के साथ मास्टर मिक्स II तैयार करें जैसा कि तालिका 2 में दिखाया गया है।
  5. आरएनए और मास्टर मिक्स 1 युक्त प्रत्येक ट्यूब में मिश्रण के 2.55 μL जोड़ें; अभिक्रिया का कुल आयतन 10 μL होना चाहिए। ट्यूबों को RT पर 10 मिनट के लिए रखें।
  6. ट्यूबों को एक शुष्क स्नान या थर्मल साइकलर और इनक्यूबेट में स्थानांतरित करें, पहले 60 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर और फिर 15 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर।
  7. इनक्यूबेशन बाद, प्रत्येक नमूने में 2x फॉर्मामाइड आरएनए लोडिंग डाई के 10 μL जोड़ें और -20 डिग्री सेल्सियस पर एक ऐक्रेलिक बॉक्स में स्टोर करें या यूरिया-पेज द्वारा टुकड़ों के पृथक्करण के साथ आगे बढ़ें, जिसमें 14 सेमी लंबा जेल और जेल छवि का विज़ुअलाइज़ेशन किया गया है जैसा कि चरण 8 में नीचे वर्णित है।
  8. एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ जेल छवि की densitometric स्कैनिंग प्रदर्शन और शामिल और छोड़ दिया उत्पादों के बैंड तीव्रता का उपयोग करने के लिए एक्सन 2 शामिल करने के प्रतिशत की गणना के रूप में नीचे दिखाया गया है.
    Equation 1

5. फ्लोरोसेंट आरटी-पीसीआर द्वारा spliced रिपोर्टर टेपों का विश्लेषण

नोट: नीचे वर्णित आरटी-पीसीआर विश्लेषण cDNA संश्लेषण के लिए यादृच्छिक हेक्सामर्स का उपयोग करता है और spliced उत्पादों के पीसीआर प्रवर्धन के लिए unlabled Dup8f और Cy5-लेबल Dup3r ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के संयोजन का उपयोग करता है।

  1. cDNA संश्लेषण के लिए, अलग-अलग 200 μL माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में transfected Hela कोशिकाओं से निकाले गए आरएनए के 2.0 μg जोड़ें और 11.0 μL तक मात्रा बनाने के लिए RNase-मुक्त पानी जोड़ें।
  2. मास्टर मिक्स I तैयार करें, जिसमें यादृच्छिक हेक्सामर्स और dNTP शामिल हैं जैसा कि तालिका 3 में दिखाया गया है और प्रत्येक नमूने में मिश्रण का 2.0 μL जोड़ें। इनक्यूबेट करें, पहले 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर फिर 1 मिनट के लिए बर्फ पर।
  3. मास्टर मिक्स II तैयार करें, जिसमें पहले स्ट्रैंड बफर, RNase अवरोधक, DTT, और रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज शामिल हैं जैसा कि तालिका 3 में दिखाया गया है और आरएनए और मास्टर मिक्स I युक्त प्रत्येक ट्यूब में मिश्रण का 7.0 μL जोड़ें।
  4. 10 मिनट के लिए आरटी पर ट्यूब रखें, और फिर 60 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस और 15 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: पूर्ण cDNA प्रतिक्रियाओं को -20 °C पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  5. पीसीआर के लिए, प्रत्येक सीडीएनए नमूने के 1.0 μL (100 ng / μL) को नए पीसीआर ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  6. Dup8f, Cy5-Dup3r, dNTPs, Taq buffer, Taq polymerase, और पानी से मिलकर एक मास्टर मिश्रण तैयार करें जैसा कि तालिका 4 में वर्णित है और cDNA युक्त प्रत्येक ट्यूब में मिश्रण का 11.5 μL जोड़ें।
  7. 3 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रारंभिक विकृतीकरण चरण के साथ एक थर्मल साइकलर का उपयोग करके पीसीआर करें; इसके बाद विकृतीकरण के 20 चक्र (30 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस), एनीलिंग (30 सेकंड के लिए 65 डिग्री सेल्सियस), और विस्तार (15 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस), और 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक समाप्ति चरण।
  8. प्रत्येक ट्यूब के लिए 2x formamide डीएनए लोडिंग डाई के 12.5 μL जोड़ें और 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी।
  9. PCR प्रतिक्रिया को -20 °C पर संग्रहीत करें या चरण 8.1-8.4 में नीचे वर्णित यूरिया-पेज के साथ आगे बढ़ें।
  10. वैद्युतकणसंचलन के बाद, वैद्युतकणसंचलन उपकरण से कांच की प्लेटों को हटा दें और जेल की कल्पना करने के लिए एक प्रतिदीप्ति इमेजर का उपयोग करके स्कैन करें।
  11. जेल छवि की densitometric स्कैनिंग निष्पादित करें और चरण 4.8 में वर्णित के रूप में exon 2 समावेशन के प्रतिशत की गणना करने के लिए शामिल और छोड़े गए उत्पादों की बैंड तीव्रता का उपयोग करें।

6. प्राइमर विस्तार द्वारा संस्करण U1 snRNA अभिव्यक्ति का विश्लेषण

  1. अलग 200 μL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में हेला कोशिकाओं से निकाले गए आरएनए के 2.0 μg जोड़ें और 4.325 μL की मात्रा बनाने के लिए RNase-मुक्त पानी जोड़ें और फिर dATP जोड़ें, जैसा कि तालिका 5 में दिखाया गया है।
  2. प्रत्येक ट्यूब में 32P-U17-26-R ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड के 10,000 सीपीएम जोड़ें।
    नोट: 32P-U17-26-R (चरण 3 से) का 10,000 सीपीएम / μL समाधान तैयार करने के लिए, लेबल किए गए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड (1: 20 कमजोर पड़ने) को पतला करें, एक सिंटिलेशन काउंटर का उपयोग करके 1.0 μL में सीपीएम निर्धारित करें, और एक नए 1.5 mL माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में 10,000 सीपीएम / μL का समाधान तैयार करने के लिए विआयनीकृत पानी के साथ पतला करें।
  3. 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, और फिर 1 मिनट के लिए बर्फ पर।
  4. तालिका 5 में दिखाए गए अनुसार 5x फर्स्ट स्ट्रैंड बफर, RNase अवरोधक, DTT, और रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज के साथ एक मास्टर मिश्रण तैयार करें और प्रत्येक नमूने में मिश्रण का 1.8 μL जोड़ें।
  5. इनक्यूबेट, पहले 10 मिनट के लिए आरटी पर और फिर 10 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर।
  6. इनक्यूबेशन बाद, प्रत्येक नमूने में 2x फॉर्मामाइड आरएनए लोडिंग डाई के 10 μL जोड़ें और -20 डिग्री सेल्सियस पर एक ऐक्रेलिक बॉक्स में स्टोर करें या 38 सेमी लंबे जेल का उपयोग करके यूरिया-पेज द्वारा टुकड़ों के पृथक्करण के साथ आगे बढ़ें (चरण 8 देखें)।

7. आरटी-qPCR द्वारा संस्करण U1 snRNA अभिव्यक्ति का विश्लेषण

  1. चरण 5.1 - 5.4 में ऊपर वर्णित के रूप में तैयार cDNA स्टॉक को 0.2 ng / μL की एकाग्रता के लिए पतला करें।
  2. पिपेट 5.0 μL पतला cDNA के एक 96-अच्छी तरह से qPCR प्लेट के अलग-अलग कुओं में तीन प्रतियों में. नो-टेम्पलेट नियंत्रण (NTC) के लिए cDNA के बजाय विआयनीकृत पानी जोड़ें।
  3. U1 और U2 snRNas के लिए आगे और रिवर्स प्राइमरों से मिलकर दो अलग-अलग प्राइमर मिश्रण तैयार करें, और तालिका 6 में दिखाए गए अनुसार पानी।
    नोट: U1 और U2 snRNA विशिष्ट प्राइमरों के लिए अनुक्रम तालिका 7 में प्रदान किए गए हैं।
  4. नमूना और NTC कुओं के लिए U1 और U2 snRNA प्राइमर मिश्रण के 5.0 μL जोड़ें।
  5. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए वास्तविक समय पीसीआर मिश्रण के 10.0 μL जोड़ें।
  6. एक ऑप्टिकल फिल्म के साथ प्लेटों को सील करें, फिर कुएं के नीचे प्रतिक्रियाओं को इकट्ठा करने के लिए आरटी में 2 मिनट के लिए 1,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  7. 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रारंभिक विकृतीकरण चरण के साथ qPCR निष्पादित करें, इसके बाद एक 2-चरण प्रोटोकॉल के 40 चक्रों के बाद जिसमें विकृतीकरण (15 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस) और एनीलिंग / एक्सटेंशन (60 सेकंड के लिए 62 डिग्री सेल्सियस) शामिल हैं, जबकि लक्ष्य एम्प्लिकॉन के थ्रेशोल्ड परिमाणीकरण चक्र (सीक्यू) मूल्यों को इकट्ठा करते हैं।
  8. U1 और U2 snRNA प्रतिक्रियाओं के लिए पृथक्करण वक्र में एक एकल चोटी की जाँच करके qPCR प्रतिक्रिया समाप्त करें।
  9. Cq मानों से, PCDNA नियंत्रण की तुलना में U1 और U2 snRNAs के लिए डेल्टा Cq (ΠCq) की गणना करें।
  10. सभी नमूनों के लिए नीचे दिखाए गए अनुसार, U2 की तुलना में U1 की सापेक्ष मात्रा (RQ) के रूप में भिन्न U1 snRNA व्यंजक निर्धारित कीजिये।
    Equation 2
    Equation 3
    Equation 4

8. सेटअप और यूरिया पेज जैल के चल रहा है

नोट: कांच की प्लेटों की असेंबली और जेल चल रहे उपकरण निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया जाना चाहिए। 10% यूरिया-पेज जेल की कास्टिंग समर एट अल.10 द्वारा पहले से वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार की जा सकती है। मार्करों और नमूनों की तैयारी, और जैल के चलने और विज़ुअलाइज़ेशन से जुड़े चरणों का वर्णन नीचे किया गया है। वैकल्पिक रूप से, जेल को कांच की प्लेटों से चिपकने से रोकने के लिए, आंतरिक सतह को सतह पर समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़कर सिलिकॉन समाधान के साथ लेपित किया जा सकता है और समान रूप से ऊतक के साथ पूरी सतह पर फैल सकता है। एक बार सूखने के बाद, प्लेटों को विआयनीकृत पानी से धोया जाना चाहिए और फिर से सुखाया जाना चाहिए।

चेतावनी: Unpolymerized एक्रिलामाइड neurotoxic है और सामग्री सुरक्षा डेटा शीट में अनुशंसित सुरक्षा के साथ संभाला जाना चाहिए।

  1. प्राइमर एक्सटेंशन नमूने और मार्करों को 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग करके तैयार करें और फिर आरटी में 5 एस के लिए 3,000 एक्स जी पर एक टेबलटॉप माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में सेंट्रीफ्यूजिंग करें।
  2. मार्करों और नमूनों को लोड करने से पहले, बसे हुए यूरिया को हटाने के लिए 1x टीबीई बफर के साथ कुओं को फ्लश करें।
  3. लोड 10 μL / नमूना / अच्छी तरह से और 2-3 घंटे के लिए 300-500V पर जेल चलाने के लिए या जब तक xylene साइनोल नीचे तक पहुँच जाता है।
    नोट:: 32P-लेबल मार्कर के बारे में 1,000 cpm लोड किया जा सकता है।
  4. वैद्युतकणसंचलन के बाद, वैद्युतकणसंचलन उपकरण से कांच की प्लेटों को हटा दें।
  5. ध्यान से दो प्लेटों को अलग करें ताकि जेल या तो कांच की सतह पर फ्लैट रखे और जेल को एक फिल्टर पेपर पर स्थानांतरित कर सके और इसे प्लास्टिक रैप के साथ कवर कर सके।
  6. वैक्यूम एक जेल ड्रायर का उपयोग कर 30 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर फिल्टर पेपर पर जेल सूखी.
  7. सूखे जेल को एक फॉस्फोर इमेजिंग कैसेट में रखें और रात भर आरटी पर रखें।
    नोट: फॉस्फोर स्क्रीन का उपयोग करने से पहले एक प्रकाश बॉक्स का उपयोग करके मिटा दिया जाना चाहिए।
  8. जेल छवि की कल्पना करने के लिए, स्क्रीन को हटा दें और फॉस्फोर इमेजर का उपयोग करके स्कैन करें।

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Representative Results

Splicing रिपोर्टर Dup51, एक तीन एक्सोन-दो intron minigene, मानव β-ग्लोबिन जीन से व्युत्पन्न किया गया था और पहले वर्णित किया गया है (चित्रा 1A)11,12. हमने एक उत्परिवर्ती रिपोर्टर, Dup51p बनाया, अशर सिंड्रोम से जुड़े 5'-splice साइट उत्परिवर्तन ों को पेश करके जो प्रोटोकाडेरिन 15 (PCDH15) जीन 13 के एक्सोन 3 में होते हैं। एक्सॉन 2-इंट्रॉन 2 जंक्शन पर 5'-स्प्लिस साइट अनुक्रम को CAG/ GUUGGUAUC से AUG/GUGUGUAUC में बदल दिया गया था (/यह एक्सॉन-इंट्रोन सीमा है) (चित्रा 1B)14। ये अनुक्रम परिवर्तन अंतर्जात U1 snRNA के साथ 5'-splice साइट basepairing के अनुमानित पैटर्न को बदल देते हैं और इसके परिणामस्वरूप परिपक्व प्रतिलेख (चित्रा 2) में एक्सोन 2 को छोड़ दिया जाता है। इन उत्परिवर्तनों के प्रभाव को U1 snRNA के 5'-क्षेत्र में एक प्रतिपूरक परिवर्तन द्वारा दबाया जा सकता है। U1 snRNA (U1-5a) के 5 वें स्थान पर एडेनिन के साथ यूरेसिल के प्रतिस्थापन ने Dup51p (चित्रा 1B) में 5'-splice साइट उत्परिवर्तन के प्रभाव को उलट दिया।

Dup51 और Dup51p टेपों के splicing 32P-Dup3r का उपयोग कर प्राइमर एक्सटेंशन द्वारा या Dup8f और Dup3r oligonucleotides (चित्रा 1) का उपयोग करके अर्ध मात्रात्मक आरटी-पीसीआर द्वारा निगरानी की जा सकती है; अनुक्रम तालिका 7 में दिए गए हैं। जब HeLa कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है, तो Dup51 minigene परिपक्व पूर्ण-लंबाई प्रतिलेख को व्यक्त करता है जिसमें एक्सोन 2 को कुशलतापूर्वक spliced-in किया जाता है (चित्रा 2A, B, लेन 1)। Dup51p में 5'-splice साइट उत्परिवर्तन ~ 95% से ~ 30% तक एक्सोन 2 को शामिल करने में कमी करते हैं, जिससे छोटे प्रतिलेख (लेन 5) का गठन होता है। U1-5a snRNA के साथ Dup51p का Coexpression exon 2 splicing को बचाता है और पूर्ण लंबाई प्रतिलेख (लेन 8) के गठन को पुनर्स्थापित करता है। Wildtype U1 (U1-WT) या U1-5g संस्करण के साथ Coexpression Dup51p splicing (लेन 6 और 7) पर एक समान प्रभाव नहीं पड़ता है। U1-WT, U1-5g, या U1-5a coexpression भी Dup51 रिपोर्टर (लेन 2-4) के splicing पैटर्न को नहीं बदलता है। कुल मिलाकर, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि Dup51p टेपों में एक्सोन 2 splicing का बचाव विशेष रूप से U1-5a snRNA में U>A उत्परिवर्तन के कारण है।

Transfected U1 snRNas की अभिव्यक्ति की निगरानी करने के लिए, प्राइमर एक्सटेंशन या RT-qPCR लागू किया जा सकता है। प्राइमर एक्सटेंशन द्वारा U1-5a वेरिएंट टेपों का पता लगाना U17-26 ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड का उपयोग करता है, जो 20 न्यूक्लियोटाइड लंबा है और U1 snRNA (चित्रा 3A) के 5 वें स्थान पर एडेनिन के पास बेसपेयर है। अकेले dATP की उपस्थिति में, U17-26 अंतर्जात wildtype U1 snRNA के लिए 2-3 न्यूक्लियोटाइड्स को शामिल करने की अनुमति देता है जो 22 या 23 न्यूक्लियोटाइड्स लंबे उत्पाद (चित्रा 3B, लेन 1, 2, 5, और 6) उत्पन्न करता है। U1-5a और U1-5g वेरिएंट के लिए, विस्तार 21 न्यूक्लियोटाइड्स लंबे उत्पाद (लेन 3, 4, 7 और 8) का उत्पादन करने वाले एकल एडेनोसिन के अतिरिक्त के बाद समाप्त हो जाता है। RT-qPCR द्वारा विश्लेषण अंतर्जात wildtype snRNA पर संस्करण U1 की अभिव्यक्ति में गुना वृद्धि के अनुमान की अनुमति देता है। यहां, U1 विशिष्ट प्राइमर जोड़े डिज़ाइन किए गए हैं ताकि वेरिएंट snRNA (चित्रा 3A) में पेश किए गए उत्परिवर्तनों के साथ कोई ओवरलैप मौजूद न हो। U2 snRNA अभिव्यक्ति के सामान्यीकरण के बाद, transfected U1-WT, और U1-5g और U1-5a वेरिएंट को अंतर्जात snRNA (चित्रा 3C) पर 3-5 सिलवटों पर व्यक्त किया गया था। अंतर्जात U1 को HeLa cells15 में प्रति सेल 106 प्रतियों पर मौजूद होने का अनुमान है। इस प्रकार, बहिर्जात संस्करण snRNas अंतर्जात U1 पर ~ 3-5 गुना पर व्यक्त कर रहे हैं। ~ 95% के लिए एक्सॉन 2 शामिल करने से बचाने के लिए U1-5a snRNA की क्षमता दर्शाती है कि बहिर्जात संस्करण snRNas के स्तर नवजात रिपोर्टर टेपों के splicing के लिए पर्याप्त हैं।

सामग्री एक प्रतिक्रिया के लिए राशि
PNK बफ़र (10x) 2.0 μL
T4 पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेज (T4 PNK) (10,000 U/ 1.0 μL
ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड * (10 μM) 10.0 μL
32 P-ATP (10 mM) 1.0 μL
H2O (DEPC उपचारित) 6.0 μL
* लेबलिंग मार्करों के लिए, pBR322 डीएनए-MspI डाइजेस्ट या कम आणविक वजन मार्कर के 0.5 μL का उपयोग किया जाता है।

तालिका 1: ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स की 32P-लेबलिंग। 32P-ATP का उपयोग कर एक 5'-32P-लेबल प्राइमर की तैयारी के लिए प्रतिक्रिया।

सामग्री - मास्टर मिक्स मैं एक प्रतिक्रिया के लिए राशि
आरएनए और एच 2 ओ (डीईपीसी का इलाज) 6.55 μL
32 P-Dup3r (2.5 μM) 0.4 μL
dNTP (10 mM) 0.5 μL
सामग्री - मास्टर मिक्स द्वितीय एक प्रतिक्रिया के लिए राशि
पहले स्ट्रैंड बफ़र (5x) 2.00 μL
RNase अवरोधक (40 U / μL) 0.25 μL
डीटीटी (0.1 मीटर) 0.05 μL
रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज (RT) (200U/ 0.25 μL

तालिका 2: 32P-Dup3r प्राइमर एक्सटेंशन. प्राइमर विस्तार द्वारा spliced रिपोर्टर टेपों के विश्लेषण के लिए प्रतिक्रिया.

सामग्री - मास्टर मिक्स मैं एक प्रतिक्रिया के लिए राशि
आरएनए और डीडीएच 2 ओ (डीईपीसी का इलाज) 11.0 μL
यादृच्छिक हेक्सामर (50 ng/ 1.0 μL
dNTP (10 mM) 1.0 μL
सामग्री - मास्टर मिक्स द्वितीय एक प्रतिक्रिया के लिए राशि
पहले स्ट्रैंड बफ़र (5x) 4.0 μL
RNase अवरोधक (40 U / μL) 1.0 μL
डीटीटी (0.1 मीटर) 1.0 μL
रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज (RT) (200U/ 1.0 μL

तालिका 3: cDNA संश्लेषण. कुल आरएनए से सीडीएनए के संश्लेषण के लिए प्रतिक्रिया।

सामग्री एक प्रतिक्रिया के लिए राशि
cDNA टेम्पलेट (100 ng/ 1.00 μL
फॉरवर्ड प्राइमर (Dup8f) (10 μM) 0.25 μL
Cy5 रिवर्स प्राइमर (Cy5-Dup3r) (10 μM) 0.25 μL
dNTP (10 μM) 0.25 μL
Taq बफर (10x) 1.25 μL
Taq डीएनए पोलीमरेज़ (5000 U / mL) 0.25 μL
H2O (DEPC उपचारित) 9.25 μL

तालिका 4: फ्लोरोसेंट आरटी-पीसीआर। Cy5-लेबल प्राइमर का उपयोग कर आरटी-पीसीआर द्वारा spliced रिपोर्टर टेपों के विश्लेषण के लिए प्रतिक्रिया।

सामग्री एक प्रतिक्रिया के लिए राशि
आरएनए और एच 2 ओ (डीईपीसी का इलाज) 4.325 μL
dATP (10 mM) 0.375 μL
32 P-U17-26-R oligo न्यूक्लियोटाइड * 1.000 μL
सामग्री - मास्टर मिक्स एक प्रतिक्रिया के लिए राशि
पहले स्ट्रैंड बफ़र (5x) 1.5 μL
RNase अवरोधक (40 U / μL) 0.1 μL
डीटीटी (0.1 मीटर) 0.1 μL
रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज (RT) (200U/ 0.1 μL
* 32P-U17-26-R ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड के 10,000 सीपीएम को पतला आरएनए (चरण 6.2.) में जोड़ा जाना चाहिए।

तालिका 5: 32P-U1-snRNA प्राइमर एक्सटेंशन. प्राइमर विस्तार द्वारा संस्करण U1 snRNA अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए प्रतिक्रिया.

सामग्री एक प्रतिक्रिया के लिए राशि
रियल टाइम पीसीआर मिक्स 10.0 μL
cDNA (0.2 ng/μL) 5.0 μL
आगे प्राइमर (10 μM) 0.2 μL
रिवर्स प्राइमर (10 μM) 0.2 μL
H2O (DEPC उपचारित) 4.6 μL

तालिका 6: मात्रात्मक RT-qPCR. RT-qPCR द्वारा वैरिएंट U1 snRNA अभिव्यक्ति के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए प्रतिक्रियाएं।

ओलिगो नाम अनुक्रम (5' करने के लिए 3') तकनीक
Dup8f GACACCATGCATGCATGGTGCACC फ्लोरोसेंट आरटी-पीसीआर
Cy5-Dup3r /5Cy5/AACAGCATCAGGAGTGGACAGATCCC फ्लोरोसेंट आरटी-पीसीआर
Dup3r AACAGCATCAGGAGGTGGACAGATCCC प्राइमर एक्सटेंशन
U17-26R TGGTATCTCCCCTGCCAGGT प्राइमर एक्सटेंशन
U1/17-39F GGAGATACCATGATCACGAAGG RT-qPCR
U1/58-80R CATCCGGAGTGCAATGGATAAG RT-qPCR
U2/8-19F CTCGGCCTTTTGGCTAAGATCA RT-qPCR
U2/62-84R TCCTCGGATAGAGGAGGTATCA RT-qPCR

तालिका 7: ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स प्राइमरों का अनुक्रम। प्राइमर नामों, अनुक्रमों और उस तकनीक की सूची जिसके लिए प्राइमरों का उपयोग किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: Dup51 और Dup51p Minigene Reporters. (A) तीन-एक्सोन / दो-इंट्रोन मिनिजीन रिपोर्टरों, Dup51 और Dup51p का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। Exons 1 और 3 में Dup8f और Dup3r के स्थान, क्रमशः, इंगित किए गए हैं। (बी) Dup51 और Dup51p रिपोर्टर टेपों के 5'-splice साइट अनुक्रमों के साथ wildtype U1 snRNA और U1-5a संस्करण के basepairing की भविष्यवाणी की। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: Spliced रिपोर्टर टेपों का विश्लेषण. HeLa कोशिकाओं Dup51 या Dup51p minigene plasmids और pcDNA नियंत्रण या PNS6U1 plasmids U1-WT, U1-5g, या U1-5a snRNas के लिए plasmids के साथ cotransfected थे। (ए) 32P-लेबल Dup3r प्राइमर Dup51 और Dup51p minigene टेपों के splicing का प्रदर्शन के साथ प्राइमर विस्तार विश्लेषण. एमआरएनए उत्पादों को जेल छवि के बाईं ओर इंगित किया जाता है। पूर्ण लंबाई वाले उत्पाद (± एसडी, एन = 3) के प्रतिशत की गणना दो एमआरएनए आइसोफॉर्मों की बैंड तीव्रता से की गई थी और इसे नीचे दिए गए ग्राफ में दर्शाया गया है। (बी) Dup8f और Cy5-Dup3r प्राइमरों के साथ RT-PCR विश्लेषण cDNA पर कुल आरएनए से तैयार किया गया है जो HeLa कोशिकाओं से निकाले गए कुल आरएनए से तैयार किया गया है जो Dup51 या Dup51p मिनीजीन टेपों के splicing का प्रदर्शन करता है। एमआरएनए उत्पादों को जेल छवि के बाईं ओर इंगित किया जाता है। पूर्ण लंबाई वाले उत्पाद (± एसडी, एन = 3) के प्रतिशत की गणना दो एमआरएनए आइसोफॉर्मों की बैंड तीव्रता से की गई थी और इसे नीचे दिए गए ग्राफ में दर्शाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: संस्करण U1-5a snRNA का विश्लेषण। HeLa कोशिकाओं Dup51 या Dup51p minigene plasmids और pcDNA नियंत्रण या PNS6U1 plasmids U1-WT, U1-5g, या U1-5a snRNas के लिए plasmids के साथ cotransfected थे। (ए) यू 1 एसएनआरएनए अनुक्रम का एक द्वि-आयामी प्रतिनिधित्व। U17-26R प्राइमर की स्थिति, U1 snRNA के प्राइमर विस्तार विश्लेषण के लिए उपयोग की जाती है, लाल रेखा द्वारा इंगित की जाती है। U1/17-39F और U1/58-80R प्राइमरों की स्थिति, जिसका उपयोग U1 snRNA के RT-qPCR के लिए किया जाता है, नीली रेखाओं द्वारा इंगित किया जाता है। (बी) वाइल्डटाइप यू 1 एसएनआरएनए, और यू 1-5 जी और यू 1-5 ए वेरिएंट की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए 32 पी-लेबल वाले U17-26 के साथ प्राइमर एक्सटेंशन विश्लेषण। U1-WT से बने उत्पादों की स्थिति और snRNAs के संस्करणों को इंगित किया गया है। (C) हेला कोशिकाओं में U1 snRNA अभिव्यक्ति के स्तर का RT-qPCR विश्लेषण। U1-snRNA अभिव्यक्ति में गुना परिवर्तन pcDNA नकारात्मक नियंत्रण के सापेक्ष गणना की गई थी और U2-snRNA के लिए सामान्यीकृत, गुना परिवर्तन (± s.d.; n = 3) U1 में रेखांकित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

परख हेला के अलावा अन्य सेल लाइनों में splicing विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, हालांकि, अभिकर्मक दक्षता को प्रभावित करने वाले कारक, जैसे सेल कन्फ्लूएंसी और डीएनए की मात्रा को अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है। U1 निर्माण अनुपात के लिए रिपोर्टर एक और महत्वपूर्ण पैरामीटर है जिसे अन्य सेल प्रकारों में देखे गए अभिव्यक्ति स्तरों के आधार पर निर्धारित करने की आवश्यकता हो सकती है। निकाले गए आरएनए की गुणवत्ता स्प्लिसिंग विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है; इसलिए, RNase मुक्त पानी का उपयोग और RNase निष्क्रिय एजेंटों के साथ सतहों के decontamination अत्यधिक अनुशंसित है।

या तो प्राइमर एक्सटेंशन या फ्लोरोसेंट आरटी-पीसीआर द्वारा रिपोर्टर टेपों के विश्लेषण से समान परिणाम मिलते हैं, इसलिए परिपक्व प्रतिलेख में एक्सोन 2 को शामिल करने में परिवर्तनों की निगरानी के लिए या तो तकनीक का उपयोग किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट पीसीआर प्रतिक्रिया को प्रवर्धन के घातीय चरण में रोका और परिमाणित किया जाना चाहिए, जो प्रारंभिक आरएनए एकाग्रता पर निर्भर है। इस प्रकार, प्रवर्धन चक्रों की संख्या को यहां वर्णित लोगों की तुलना में विभिन्न अभिकर्मकों की स्थिति के साथ assays के लिए निर्धारित किया जा सकता है। गैर रेडियोधर्मी प्रकृति के कारण उपयोग में आसानी आरटी-पीसीआर परख का एक लाभ है। हालांकि रेडियोधर्मी रूप से लेबल किए गए प्राइमर के साथ प्राइमर विस्तार के लिए अतिरिक्त सुरक्षा सावधानियों की आवश्यकता होती है, यह आरएनए की कम मात्रा से संकेतों का पता लगा सकता है। प्राइमर विस्तार और आरटी-पीसीआर के कम थ्रूपुट इस परख की एक सीमा है।

U1 snRNP पूरक परख कई उद्देश्यों के लिए नियोजित किया गया है. 5'-splice साइट उत्परिवर्तन के प्रभावों को उलटने के अलावा, U1 snRNas 5'-क्षेत्र में परिवर्तन ले जाने के लिए जीन मौन और splicing तंत्र का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है। Fortes et al. से पता चला है कि अंतर्जात टेपों के टर्मिनल exons करने के लिए U1 snRNAs को लक्षित करने से जीन अभिव्यक्ति 16 को कुशलतापूर्वक बाधित किया जा सकता है। Roca et al. ने U1 पूरकता का उपयोग 5'-splice साइट मान्यता के noncanonical तंत्र का अध्ययन करने के लिए किया और दिखाया कि U1 snRNA एक वैकल्पिक रजिस्टर में 5'-splice साइटों के लिए basepair कर सकता है जहां basepairing को एक न्यूक्लियोटाइड द्वारा स्थानांतरित किया जाता है और "उभार रजिस्टरों" में भी जहां उभरे हुए न्यूक्लियोटाइड या तो पूर्व-mRNA या snRNA17 में मौजूद होते हैं, १८ । इस रिपोर्टर प्रणाली का उपयोग संभावित रूप से छोटे अणुओं और splicing नियामक प्रोटीन द्वारा मॉडुलन को splicing में U1 snRNP की भूमिका का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। एक लक्ष्य एक्सन के साथ Dup51p के एक्सन 2 प्रतिस्थापन द्वारा, परख छोटे अणुओं है कि बढ़ाने या विशिष्ट exons के splicing दबाने के लिए जाना जाता है की कार्रवाई के तंत्र की जांच के लिए लागू किया जा सकता है, के रूप में splice स्विचिंग यौगिकों के मामले में 19. एक्सोन या इंट्रोन में वैकल्पिक स्प्लिसिंग कारकों के लिए नियामक अनुक्रमों को शामिल करके, स्प्लिसिंग विनियमन में यू 1 निर्भरता की जांच करना संभव होना चाहिए। इस अवधारणा को हामिद एट अल द्वारा पॉलीपाइरीमिडिन ट्रैक्ट बाइंडिंग प्रोटीन 120 द्वारा स्प्लिसिंग विनियमन में यू 1 एसएनआरएनए के स्टेम-लूप 4 की भागीदारी को प्रदर्शित करने के लिए लागू किया गया था। हम इस परख का उपयोग करने के लिए स्टेम के कार्यों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया है-loops 3 और U1 snRNA के 4. दमनकारी U1-5a snRNA के स्टेम-लूप में उत्परिवर्तन को शामिल करके जो Dup51p splicing रिपोर्टर में एक उत्परिवर्ती 5'-splice साइट को सक्रिय करता है, हमने spliceosome assembly14,21 के शुरुआती चरणों में U2 snRNP विशिष्ट प्रोटीन SF3A1 के साथ क्रॉस इंट्रोन संपर्कों के गठन में उनकी महत्वपूर्ण भूमिकाओं की पहचान की है। इस प्रकार, तीन-एक्सोन टू-इंट्रॉन डुप 51 रिपोर्टर स्प्लिसोसोम असेंबली और स्प्लिसिंग-संबंधित बीमारी के अंतर्निहित तंत्र पर अध्ययन में स्प्लिसिंग दक्षता की निगरानी के लिए एक अनुकूली उपकरण के रूप में कार्य करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R21CA170786 और R01GM127464) और अमेरिकन कैंसर सोसाइटी (संस्थागत अनुसंधान अनुदान 74-001-34-IRG) और घाटी अनुसंधान भागीदारी कार्यक्रम (P1-4009 और VRP77) से एसएस और डब्ल्यू.M को धन द्वारा समर्थित किया गया था। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent Grade Deionized Water ThermoFisher Scientific 23-751628
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich D5758-25ML
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder packet Gibco 12100-046
Sodium Bicarbonate ThermoFisher Scientific S233-500
Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat Inactivated Omega Scientific FB-22
Penicillin-Streptomycin (P/S) Sigma-Aldrich P4458-100ML
Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0N Sigma-Aldrich S2567-16A
Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0% ThermoFisher Scientific A144-500
Disposable PES Bottle Top Filters ThermoFisher Scientific FB12566510
EDTA Disodium Salt Dihydrate Amresco 0105-2.5KG
2.5% Trypsin (10x), no phenol red ThermoFisher Scientific 15090046
Sodium Chloride Fisher Bioreagent BP358-212
Potassium Chloride Fisher Bioreagent BP366-1
Disodium Hydrogen Phosphate Heptahydrate Fisher Bioreagent BP332-1
Potassium Dihydrogen Phosphate Fisher Bioreagent BP362-1
Transfection medium - Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium, no phenol red ThermoFisher Scientific 11058021
Transfection Reagent - Lipofectamine™ 2000 ThermoFisher Scientific 13778150
TRIzol™ Reagent ThermoFisher Scientific 15596018
Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) ThermoFisher Scientific BP1145-1
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents ThermoFisher Scientific BP2818-4
Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents ThermoFisher Scientific BP2618-212
Glycogen (5 mg/ml) ThermoFisher Scientific AM9510
Direct-zol RNA Miniprep Kit Zymo Research R2052
ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCi PerkinElmer NEG035C001MC
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201L
Size exclusion beands - Sephadex® G-25 Sigma-Aldrich G2580-10G
Size exclusion mini columns USA Scientific 1415-0600
pBR322 DNA-MspI Digest New England Biolabs N3032S
Low Molecular Weight Marker, 10-100 nt Affymetrix 76410 100 UL
Rnase inactivating reagents - RNaseZAP™ Sigma-Aldrich R2020-250ML
dNTP Mix (10 mM ea) ThermoFisher Scientific 18427013
RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor ThermoFisher Scientific 10777019
Reverse Transcriptase - M-MLV Reverse Transcriptase ThermoFisher Scientific 28025013 used for primer extension
Taq DNA Polymerase ThermoFisher Scientific 10342020
Random Hexamers (50 µM) ThermoFisher Scientific N8080127
Real time PCR mix - SYBR™ Select Master Mix ThermoFisher Scientific 4472903
SuperScript™ III Reverse Transcriptase ThermoFisher Scientific 18080093 used for cDNA preparation
Dithiothreitol (DTT) ThermoFisher Scientific 18080093
5X First-Strand Buffer ThermoFisher Scientific 18080093
Formamide (≥99.5%) ThermoFisher Scientific BP228-100 Review Material Safety Data Sheets
Bromophenol Blue sodium salt Sigma-Aldrich 114405-5G
Xylene Cyanol FF Sigma-Aldrich 2650-17-1
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) ThermoFisher Scientific BP152-5
Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis) ThermoFisher Scientific BP168-500
Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis) ThermoFisher Scientific BP1406-1 Review Material Safety Data Sheets
Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.) ThermoFisher Scientific BP169-212
Ammonium peroxodisulphate (APS) ≥98%, Pro-Pure, Proteomics Grade VWR M133-25G
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2-100ML
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) ≥99%, Ultrapure VWR 0761-25ML Review Material Safety Data Sheets
Adjustable Slab Gel Systems, Expedeon VWR ASG-400
Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cm VWR NGP-125NR
Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cm VWR NGP-200NR
Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cm VWR NGP-400NR
GE Storage Phosphor Screens Sigma-Aldrich GE28-9564
Typhoon™ FLA 7000 Biomolecular Imager GE Healthcare 28-9610-73 AB
Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation Counter GMI 8043-30-1194
C1000 Touch Thermal Cycler ThermoFisher Scientific
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems ThermoFisher Scientific

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References

  1. Zhuang, Y., Weiner, A. M. A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5' splice site mutation. Cell. 46 (6), 827-835 (1986).
  2. Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nature Review Genetics. 17 (1), 19-32 (2016).
  3. Ward, A. J., Cooper, T. A. The pathobiology of splicing. Journal of Pathology. 220 (2), 152-163 (2010).
  4. Scalet, D., et al. Disease-causing variants of the conserved +2T of 5' splice sites can be rescued by engineered U1snRNAs. Human Mutatation. 40 (1), 48-52 (2019).
  5. Yamazaki, N., et al. Use of modified U1 small nuclear RNA for rescue from exon 7 skipping caused by 5'-splice site mutation of human cathepsin A gene. Gene. 677, 41-48 (2018).
  6. Yanaizu, M., Sakai, K., Tosaki, Y., Kino, Y., Satoh, J. I. Small nuclear RNA-mediated modulation of splicing reveals a therapeutic strategy for a TREM2 mutation and its post-transcriptional regulation. Science Reports. 8 (1), 6937 (2018).
  7. Balestra, D., et al. Splicing mutations impairing CDKL5 expression and activity can be efficiently rescued by U1snRNA-based therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 20174130 (2019).
  8. Donadon, I., et al. Exon-specific U1 snRNAs improve ELP1 exon 20 definition and rescue ELP1 protein expression in a familial dysautonomia mouse model. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2466-2476 (2018).
  9. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
  10. Summer, H., Gramer, R., Droge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485 (2009).
  11. Dominski, Z., Kole, R. Selection of splice sites in pre-mRNAs with short internal exons. Molecular Cell Biology. 11 (12), 6075-6083 (1991).
  12. Amir-Ahmady, B., Boutz, P. L., Markovtsov, V., Phillips, M. L., Black, D. L. Exon repression by polypyrimidine tract binding protein. RNA. 11 (5), 699-716 (2005).
  13. Le Guedard-Mereuze, S., et al. Sequence contexts that determine the pathogenicity of base substitutions at position +3 of donor splice-sites. Human Mutation. 30 (9), 1329-1339 (2009).
  14. Sharma, S., Wongpalee, S. P., Vashisht, A., Wohlschlegel, J. A., Black, D. L. Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly. Genes and Development. 28 (22), 2518-2531 (2014).
  15. Steitz, J. A., et al. Functions of the abundant U-snRNPs. Structure and function of major and minor small nuclear ribonucleoprotein particles. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 115-154 (1988).
  16. Fortes, P., et al. Inhibiting expression of specific genes in mammalian cells with 5' end-mutated U1 small nuclear RNAs targeted to terminal exons of pre-mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100 (14), 8264-8269 (2003).
  17. Roca, X., et al. Widespread recognition of 5' splice sites by noncanonical base-pairing to U1 snRNA involving bulged nucleotides. Genes and Development. 26 (10), 1098-1109 (2012).
  18. Roca, X., Krainer, A. R. Recognition of atypical 5' splice sites by shifted base-pairing to U1 snRNA. Nature Structural Molecular Biology. 16 (2), 176-182 (2009).
  19. Taladriz-Sender, A., Campbell, E., Burley, G. A. Splice-switching small molecules: A new therapeutic approach to modulate gene expression. Methods. 167, 134-142 (2019).
  20. Hamid, F. M., Makeyev, E. V. A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).
  21. Martelly, W., et al. Synergistic roles for human U1 snRNA stem-loops in pre-mRNA splicing. RNA Biology. , 1-18 (2021).

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जैव रसायन अंक 175 आरएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन पूर्व-mRNA splicing spliceosome U1 snRNP intron एक्सोन splice साइट Dup51p रिपोर्टर एक्सोन स्किपिंग
एक रिपोर्टर आधारित सेलुलर परख निगरानी Splicing दक्षता के लिए
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Wong, J., Martelly, W., Sharma, S. A … More

Wong, J., Martelly, W., Sharma, S. A Reporter Based Cellular Assay for Monitoring Splicing Efficiency. J. Vis. Exp. (175), e63014, doi:10.3791/63014 (2021).

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