Prøvepræparat ved hjælp af en Lipid Monolayer-metode til elektronkrygrafiske studier

Summary

Lipid monolayers er blevet brugt som et fundament for at danne to-dimensionelle (2D) protein krystaller til strukturelle undersøgelser i årtier. De er stabile ved luft-vand interface og kan tjene som en tynd støtte materiale til elektron imaging. Her præsenterer vi de dokumenterede trin til forberedelse af lipidmonomer til biologiske undersøgelser.

Abstract

Elektronkrystallografi er et kraftfuldt værktøj til strukturbestemmelse med høj opløsning. Makromolekyler såsom opløselige eller membranproteiner kan dyrkes til højt ordnede todimensionelle (2D) krystaller under gunstige forhold. Kvaliteten af de dyrkede 2D-krystaller er afgørende for opløsningen af den endelige genopbygning via 2D-billedbehandling. I årenes løb er lipidmonomer blevet brugt som et støttelag til at fremme 2D-krystallisering af perifere membranproteiner samt opløselige proteiner. Denne metode kan også anvendes på 2D krystallisering af integrerede membranproteiner, men kræver mere omfattende empirisk undersøgelse for at bestemme vaskemiddel og dialyse betingelser for at fremme partitionering til monolayer. En lipid monolayer dannes på luft-vand interface således, at polar lipid hoved grupper forbliver hydreret i den vandige fase og de ikke-polære, acyl kæder, haler partition i luften, bryde overfladespændingen og udfladning vandoverfladen. Hovedgruppernes ladede natur eller karakteristiske kemiske moieties giver affinitet for proteiner i opløsning, der fremmer binding til 2D-arraydannelse. En nydannet monolag med 2D-arrayet kan let overføres til et elektronmikroskop (EM) på et kulstofbelagt kobbergitter, der bruges til at løfte og understøtte det krystallinske array. I dette arbejde beskriver vi en lipid monolayer metode til kryogen elektron mikroskopisk (cryo-EM) billeddannelse.

Introduction

Elektron diffraktion gennem 2D krystaller eller spiralformede arrays af proteiner kan opnå sub-nanometer opløsninger i gunstige tilfælde^1,2,3. Af særlig interesse er rekonstitueret 2D membran protein arrays eller krystaller i deres nær-indfødte miljøer¹. Fordi en krystal fungerer som en signalforstærker øge intensiteten af de strukturelle faktorer ved specifikke rumlige frekvenser, elektron krystallografi tillader sondering et mål med en mindre størrelse ved høje opløsninger, såsom små molekyler, end dem for enkelt-partikel cryo-EM. Elektronstrålen kan diffrakteres af en ordnet 2D-vifte af proteiner, hvilket genererer et diffraktionsmønster eller et gitterbillede afhængigt af, hvor billedplanet er optaget på^{detektoren 4}. De diffracted intensiteter kan derefter udvindes og behandles for at rekonstruere en 2D projektion struktur af krystallen. Elektroner har en større spredning tværsnit end røntgenstråler og dens spredning for det meste følger Rutherford model baseret på Coulomb interaktion mellem elektroner og ladede atomer i^{molekylet 5}. Tykkelserne af 2D-membrankrystaller er normalt mindre end 100 nm, egnet til elektrontransmission uden dynamisk spredning, der forekommer i prøve⁶. Elektronkrystalgrafiske undersøgelser har vist sig at være et kraftfuldt værktøj til at sondere strukturelle oplysninger i høj opløsning af membranproteiner og lipidproteininteraktioner^{7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17}.

En lipid monolayer er et enkelt lipidlag bestående af fosfolipider tæt pakket ved en luft-vand interface⁶, som kan hjælpe 2D array dannelse for opløselige proteiner eller perifere membran proteiner¹⁸. Afhængigt af lipidernes massefylde og deres laterale tryk kan lipidmolekylerne danne et ordnet 2D-array på luftvandsgrænsefladen med deres acylkæder udvidet til luften og hydrofile hovedgrupper, der eksponeres i den vandige opløsning^1,6,19. Lipid hovedgruppen kan interagere med proteiner via elektrostatisk interaktion eller kan ændres til at give en affinitet tag til at binde et bestemt protein domæne. For eksempel bruges DOGS-NTA-Ni (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl]^2- Ni²⁺) ofte til at danne en lipid monolayer til at binde proteinerne med et poly-histidin tag^20,21,22. Også kolera toksin B kan binde en bestemt pentasaccharid af ganglioside GM1 i en lipid monolayer til strukturelle undersøgelser^23,24. Ved at forankre proteinerne på lipidhovedgrupperne kan lipidmonomonlayeren hjælpe med dannelsen af 2D-arrays, der er tynde til elektronkrystalgrafiske undersøgelser med høj opløsning. Lipid monolayer teknikken er blevet anvendt i elektronkrystallografi til strukturelle undersøgelser af proteiner, såsom streptavidin^2,25, annexin V²⁶, kolera toksin²⁷, E. coli gyrase B subunit²⁸, E. coli RNA polymerase^25,29,30, carboxysome shell proteiner³¹ og capsid proteiner hiv-1³² og Moloney murin leukæmi virus ³³. På grund af stabiliteten og den kemiske egenskab af lipid monolayer, forskellige anvendelser for prøve forberedelse er blevet undersøgt for cryo-EM imaging³⁴. Optimering vil dog være nødvendig for protein array dannelse.

Her giver vi omfattende detaljer om den generelle forberedelse af lipidmonomer til kryo-EM-billeddannelse og nogle overvejelser, der kan påvirke kvaliteten af de dannede monolayers.

Protocol

1. Forberedelse af teflonblok Tilbered teflonblokken fra kemisk resistent PTFE -harpiks (polytetrafluoroethylen). Lav huller på blokken ved hjælp af en generel boremaskine efterfulgt af de dimensioner, der er mærket i figur 1. 2. Monolayer lipid forberedelse BEMÆRK: Anslået driftstid: 30- 45 minutter Lipid lager forberedelse Der fremstilles en 0,01 mg/mL lipidbland…

Representative Results

En lipid monolayer deponeret på EM nettet kan visualiseres under en transmission elektron mikroskop (TEM) uden farvning. Monolagstilstedeværelsen kan genkendes af kontrastforskellen fra området uden nogen prøve i strålestien. Områder, der har lipid monolayer dækning har lavere lokal kontrast end dem uden dækning, da elektronstrålen gennem de tomme huller ikke har nogen spredning og viser en lysere belysning (Figur 3). For at screene betingelserne for 2D m…

Discussion

En lipid monolayer er et kraftfuldt værktøj, der letter væksten af store 2D-krystaller til strukturelle undersøgelser af biologiske makromolekyler. For at kunne forberede en intakt lipid monolayer på luft-vand interface, anbefales det kraftigt, at lipider fremstilles frisk på dagen for eksperimentet, fordi oxidering af lipid acyl kæde kan føre til pakning forstyrrelser i monolayer og negativt påvirke den resulterende krystal dannelse. Købte lipider i pulverform skal opløses ved hjælp af en blanding af chlorof…

Materials

14:0 PC (DMPC)	Avanti Lipids	850345	1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL
Bulb for small pipets	Fisher Scientific	03-448-21
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
Desiccator vacuum	Southern Labware	55207
EM grids	Electron Microscopy Sciences	CF413-50	CF-1.2/1.3-4C 1.2 µm hole, 1.3 µm space
Filter paper	GE Healthcare Life Sciences	1001-090	Diameter 90 mm
Glass Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Hamilton syringe (25 µL)	Hamilton Company	80465
Hamilton syringe (250 µL)	Hamilton Company	81165
Hamilton syringe (5 µL)	Hamilton Company	87930
Hamilton syringe (500 µL)	Hamilton Company	203080
Methanol	Sigma-Aldrich	M1775-1GA
Petri dish	VWR	25384-342	100 mm × 15 mm
Teflon block	Grainger	55UK05	60 µL wells with side injection ports, manually made
Tweezers	Electron Microscopy Sciences	78325	Various styles
Ultra-pure water
Ultrasonic cleaner	VWR	97043-996